【作者】趙春田 彭遠義 唐國敏 王敖全 王華明

【機構】中國科學院微生物研究所微生物資源前期開發(fā)國家重點實驗室 西南農(nóng)業(yè)大學動物科技學院Genencor International Inc.PaloAltoCalifornia 北京100080 西南農(nóng)業(yè)大學動物科技學院 重慶400716 北京100080 94304 USA

【摘要】運用同源重組技術破壞了黑曲霉基因組中的pepD基因,該基因編碼一種類subtilisin的胞外蛋白酶PEPD。實驗以黑曲霉GICC2773基因組DNA為模板,PCR擴增pepD基因,并在此基因中間插入潮霉素抗性基因(hph)表達單元,由此產(chǎn)生了3.7kb的pepD阻斷基因片段。將此阻斷基因片段與載體pBS連接,構建成pepD基因阻斷質(zhì)粒pBSDH。采用原生質(zhì)體-CaCl2/PEG法將酶切阻斷質(zhì)粒得到的含pepD基因和hph表達單元的3.7kb線性片段轉(zhuǎn)化AspergillusnigerGICC2773菌株,在含潮霉素的平板上篩選潮霉素抗性轉(zhuǎn)化子,從這些抗性轉(zhuǎn)化子中經(jīng)PCR檢測分離到到1個pepD基因阻斷突變菌株?pepD66。外源漆酶分泌活性分析顯示,黑曲霉pepD基因的破壞使其外源漆酶的分泌表達有所提高。 

【基金】Joint project granted by Genencor International Inc.of USA；

【關鍵詞】同源重組; 外源蛋白; 分泌表達;