2023年4月28日，我國(guó)第一個(gè)基因編輯生物安全證書(shū)授予舜豐生物的基因編輯大豆，預(yù)示著基因編輯育種在我國(guó)的規(guī)范化和逐步合法化。目前雖然在多種食藥用菌中成功構(gòu)建了CRISPR/Cas9系統(tǒng)，但多數(shù)物種僅限于技術(shù)的可行性，靶基因多限于URA3/pyrG，少數(shù)應(yīng)用于代謝產(chǎn)物合成通路解析等，未對(duì)影響表型或性狀改良的基因進(jìn)行編輯，即未能在菌種選育中得到應(yīng)用。

2022年中國(guó)科學(xué)院微生物研究所董彩虹研究員團(tuán)隊(duì)在蛹蟲(chóng)草中建立了無(wú)痕的CRISPR/Cas9基因編輯體系，可實(shí)現(xiàn)單、雙基因的高效無(wú)痕編輯和精準(zhǔn)敲除，為蛹蟲(chóng)草基因編輯育種奠定基礎(chǔ)（Meng et al., 2022; https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35829671/），而遺傳學(xué)和育種研究中基因敲入與敲除同樣重要。

外源基因的插入往往會(huì)影響靶位點(diǎn)基因、側(cè)翼鄰近基因的表達(dá)以及染色質(zhì)狀態(tài)，進(jìn)而對(duì)宿主產(chǎn)生不良影響。基因組安全位點(diǎn)（Safe harbor）為外源基因提供一個(gè)安全可靠的停泊“港口”，使得外源基因既可以穩(wěn)定高效表達(dá)，同時(shí)不會(huì)導(dǎo)致宿主產(chǎn)生任何可識(shí)別的表型變化。以基因組、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，在蛹蟲(chóng)草基因組中鑒定出多個(gè)安全位點(diǎn)，通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行敲除和敲入驗(yàn)證，得到第一個(gè)可用的安全位點(diǎn)CmSH1。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建了一種安全位點(diǎn)靶向的CRISPR/Cas9基因敲入系統(tǒng)，通過(guò)簡(jiǎn)單的一步克隆連接即可構(gòu)建敲入載體，實(shí)現(xiàn)基因過(guò)表達(dá)或外源基因在安全位點(diǎn)的定點(diǎn)整合。利用該系統(tǒng)對(duì)蛹蟲(chóng)草疏水蛋白基因Cmhyd1進(jìn)行定點(diǎn)過(guò)表達(dá)，基因編輯菌株“白毛病”抗病性增強(qiáng)，對(duì)蛹蟲(chóng)草農(nóng)藝性狀影響微弱且不影響其子實(shí)體商品性。PCR測(cè)序和基因組重測(cè)序確認(rèn)Cmhyd1過(guò)表達(dá)菌株無(wú)脫靶和外源基因、序列殘留。

2023年10月，該研究結(jié)果以“Safe-Harbor-Targeted CRISPR/Cas9 System and Cmhyd1 Overexpression Enhances Disease Resistance in Cordyceps militaris”為題在Journal of Agricultural and Food Chemistry雜志在線發(fā)表。

本研究獲得了食用菌基因組中第一個(gè)安全位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因定點(diǎn)敲入。本研究也是無(wú)痕基因編輯獲得的第一例抗病菌株，為其他食用菌抗病育種提供借鑒，對(duì)病害的防控具有重要的科學(xué)意義和實(shí)踐價(jià)值。該研究目前已經(jīng)申請(qǐng)專(zhuān)利（專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枺?/span>202211257442.5）。本工作主要由博士生研究生劉晴完成，得到國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2022YFD1200602）和國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31872163，32272786）的資助。

原文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jafc.3c05131