我國(guó)作為全球最大的食用菌生產(chǎn)國(guó)，多年來(lái)年產(chǎn)量3500萬(wàn)噸以上，占世界3/4，同時(shí)食用菌產(chǎn)業(yè)在循環(huán)農(nóng)業(yè)和促進(jìn)農(nóng)民增收方面成效顯著，已成為我國(guó)特色農(nóng)業(yè)發(fā)展中的朝陽(yáng)產(chǎn)業(yè)。近年來(lái)隨著食用菌品種選育、種質(zhì)交流和引種栽培等工作的快速推進(jìn)，在生產(chǎn)和科研中面臨食用菌品種名稱(chēng)繁多，同物異名，異物同名現(xiàn)象普遍存在的問(wèn)題。然而現(xiàn)有的品種鑒定方法大多存在工作量大、精確性和重復(fù)性不足等問(wèn)題，極大影響了產(chǎn)業(yè)發(fā)展和種質(zhì)創(chuàng)新進(jìn)程。

多核苷酸多態(tài)性（Multiple Nucleotide Polymorphism，MNP）標(biāo)記法是繼簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple Sequence Repeats，SSR）標(biāo)記法和單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）標(biāo)記法后，于2020年成為植物品種鑒定的另一個(gè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T38551-2020）。其基本原理是在基因組內(nèi)存在多個(gè)SNP位點(diǎn)，將這些不同SNP位點(diǎn)的等位基因型組合起來(lái)，用于區(qū)分不同的個(gè)體DNA。目前MNP標(biāo)記已成功應(yīng)用于水稻、大豆、油菜、茄子、玉米、番茄等作物的品種鑒定。因?yàn)镸NP標(biāo)記法在篩選目標(biāo)區(qū)段時(shí)避開(kāi)了易出錯(cuò)的序列，如SSR和連續(xù)的SNP位點(diǎn)；其次，基于高通量測(cè)序的MNP標(biāo)記檢測(cè)克服了凝膠電泳中SSR擴(kuò)增長(zhǎng)度的不確定性和SNP標(biāo)記的微陣列雜交噪聲；MNP位點(diǎn)會(huì)通過(guò)二代測(cè)序重復(fù)檢測(cè)上千次，重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性都會(huì)得到提升。此外當(dāng)構(gòu)建完成具體物種的MNP標(biāo)記位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)后，在實(shí)驗(yàn)操作上只需要將待測(cè)樣品DNA和混合MNP標(biāo)記引物在一次PCR體系中擴(kuò)增，并測(cè)序這些位點(diǎn)的序列即可，所以檢測(cè)的實(shí)際操作非常便捷。

雖然MNP標(biāo)記技術(shù)在植物品種鑒定方面已取得了明顯成效，但由于植物的基因組顯著大于真菌基因組，此外食用菌普遍采用組織分離法復(fù)壯菌株或采用系統(tǒng)選育法育種，使得食用菌品種同質(zhì)化非常嚴(yán)重，不同品種（菌株）之間親緣關(guān)系極為密切，所以食用菌品種鑒定的標(biāo)準(zhǔn)和精確程度要求更高。此外不同品種的形態(tài)和性狀對(duì)不同栽培條件較為敏感，使得品種的準(zhǔn)確鑒定難度進(jìn)一步增大。

在本研究中，我們?cè)谥参锲贩NMNP標(biāo)記研究方法的基礎(chǔ)上，針對(duì)食用菌品種鑒定的實(shí)際需求和難點(diǎn)，開(kāi)發(fā)出適合食用菌品種鑒定的方案和流程。以我國(guó)食用菌總產(chǎn)量第一，品種名稱(chēng)超過(guò)500個(gè)的香菇[Lentinula edodes (Berk.) Pegler]為材料，在188個(gè)菌株基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，篩選得到501個(gè)廣泛MNP標(biāo)記位點(diǎn)；通過(guò)相關(guān)引物設(shè)計(jì)和對(duì)78份香菇商業(yè)品種（包括25個(gè)國(guó)家品種委員會(huì)認(rèn)定的香菇商業(yè)栽培品種、7個(gè)通過(guò)地方審定（鑒定、備案）品種、以及具有代表性狀、生物學(xué)特性和來(lái)自不同地域的栽培菌株）的多重?cái)U(kuò)增、MNP-Seq測(cè)序，構(gòu)建了我國(guó)香菇品種的MNP標(biāo)記位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)。通過(guò)檢測(cè)，它們的位點(diǎn)檢出率、重復(fù)率和準(zhǔn)確率分別為94.4%、99.92%和99.96%，表明其標(biāo)記效果良好。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步篩選187個(gè)核心MNP標(biāo)記位點(diǎn)，并利用240個(gè)菌株的核心位點(diǎn)序列構(gòu)建高精度的系統(tǒng)發(fā)育圖譜（圖1），并計(jì)算不同譜系間和品種間遺傳相似度（Genetic Similarity，GS，表1）。

研究結(jié)果表明：1）所有供試的栽培品種可以被區(qū)分為24個(gè)譜系：其中13個(gè)譜系的原始栽培品種來(lái)自日本，5個(gè)譜系來(lái)自中國(guó)（其中1個(gè)來(lái)自臺(tái)灣），3個(gè)譜系目前來(lái)源不明。綜合所有結(jié)果，除了唯一來(lái)自中國(guó)南方的栽培品種（香九）外，大多數(shù)香菇栽培品種原產(chǎn)于東北亞地區(qū)，中國(guó)的香菇品種存在嚴(yán)重的同質(zhì)化現(xiàn)象。2）劃定了區(qū)分不同譜系和品種的GS標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)GS值小于或等于94%，為不同譜系的品種；GS值在94%-99.5%之間，可以被認(rèn)為同一譜系中不同的栽培品種；當(dāng)GS值高于99.5%時(shí)，則視為同一栽培品種。3）進(jìn)一步完善了香菇品種精準(zhǔn)鑒定的快速流程，實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)室操作（只需對(duì)待測(cè)樣品一次DNA提取，一次多重PCR擴(kuò)增，一次送樣測(cè)序）后，通過(guò)MNP數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)即完成待測(cè)樣品的品種精準(zhǔn)鑒定。

本研究開(kāi)發(fā)了香菇品種鑒定的廣泛MNP標(biāo)記數(shù)據(jù)庫(kù)，并在此基礎(chǔ)上篩選出核心MNP標(biāo)記，建立了香菇栽培品種的譜系圖、譜系和品種鑒定的標(biāo)準(zhǔn)流程及區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)快速鑒定香菇品種。此項(xiàng)工作為強(qiáng)化食用菌品種的原始創(chuàng)新（初始品種），鼓勵(lì)修飾性品種創(chuàng)新（派生品種），奠定了技術(shù)保障平臺(tái)。

圖1  基于187個(gè)核心MNP序列的香菇系統(tǒng)發(fā)育圖譜

表1  香菇參試品種的遺傳相似度（GS值）

相關(guān)論文在真菌領(lǐng)域權(quán)威期刊Mycosphere（2022年影響因子16.525，JCR 1區(qū)）在線(xiàn)發(fā)表，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所碩士生凌云燕和博士生張明晢為該論文共同第一作者，湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所王卓仁高級(jí)農(nóng)藝師和中國(guó)科學(xué)院微生物研究所趙瑞琳研究員為論文共同通訊作者，江漢大學(xué)彭海教授、福建農(nóng)林大學(xué)吳小平教授為共同作者。研究工作得到了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2018YFD0400200），國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31961143010, 31970010）、北京市食用菌創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（BAIC05-2022）、中科院農(nóng)業(yè)先進(jìn)微生物技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室（KFJ-PTXM-016）和河南省重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（221111110600）的資助。

相關(guān)論文鏈接Doi 10.5943/mycosphere/si/1f/3；專(zhuān)利受理號(hào)202210530743.4。