藥用真菌液體發(fā)酵研究進(jìn)展

朱 戎 陳向東 蘭 進(jìn)

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)藥用植物研究所，北京，100094）

摘 要 : 本文綜述了藥用真菌液體發(fā)酵技術(shù)研究的進(jìn)展，指出提高目的產(chǎn)物的主要途徑是優(yōu)化培養(yǎng)基和優(yōu)化菌種。藥用真菌液體發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)可以進(jìn)行工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)，其規(guī)模大，產(chǎn)量高、發(fā)酵周期短，具有廣泛的發(fā)展前景。

關(guān)鍵詞 : 藥用真菌; 液體發(fā)酵; 產(chǎn)物

液體發(fā)酵技術(shù)是在抗生素工業(yè)發(fā)展起來后才運(yùn)用到藥用真菌發(fā)酵中的。其優(yōu)點(diǎn)是可以進(jìn)行工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)、規(guī)模大、產(chǎn)量高、發(fā)酵周期短、生產(chǎn)效益高。藥用真菌在液體發(fā)酵過程中，除菌絲或孢子會大量增殖外，還會在發(fā)酵液中產(chǎn)生多糖、多肽、生物堿、萜類化合物、甾醇、酶、核酸、氨基酸、維生素、植物激素及具有抗生素作用的各種化合物等多種具有生理活性的物質(zhì)。這些物質(zhì)分別對心血管、肝臟、神經(jīng)系統(tǒng)、腎臟、性器官等人體器官具有防病治病的作用，并有抗癌、抗炎、抗菌、抗衰老、抗?jié)兊裙π?。人們對藥用真菌的液體發(fā)酵，除獲得菌絲體外，還以獲取上述具有活性的次生代謝產(chǎn)物為目的?，F(xiàn)在許多研究表明有很多藥用真菌液體發(fā)酵的菌絲體多糖含量遠(yuǎn)高于人工栽培的藥用真菌。在液體發(fā)酵蜜環(huán)菌菌絲體的報道中所提取的粗多糖約為人工栽培的10倍。對靈芝發(fā)酵的研究也有類似的報道。近年來，藥用真菌發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用越來越廣泛。改進(jìn)發(fā)酵過程中的條件，促進(jìn)發(fā)酵過程朝向提高目的產(chǎn)物的方向進(jìn)行，提高產(chǎn)物品質(zhì)，降低發(fā)酵成本，使投入產(chǎn)出比達(dá)到最小，是液體發(fā)酵研究的一個方向。在該領(lǐng)域內(nèi)，從事液體發(fā)酵的研究人員正在試用不同的方法來實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。

1. 培養(yǎng)方法

藥用真菌在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，通過培養(yǎng)基配方比例的調(diào)整或培養(yǎng)條件的改變，所得發(fā)酵產(chǎn)物會有差異，尤其是對一些次生代謝產(chǎn)物而言，差異顯著。在這方面人們對不同的藥用真菌進(jìn)行了大量研究。

1.1靈芝

改變靈芝液體發(fā)酵條件，結(jié)果表明其最適溫度、搖瓶裝量、轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)初始pH分別為25℃、100～120ml/500ml三角瓶、120～150rpm、4.5～5.0，適宜的碳、氮源分別是玉米粉、黃豆餅粉，最適濃度分別為3%、2.5%。研究還發(fā)現(xiàn)搖瓶培養(yǎng)過程中菌絲球直徑在0.85～0.9時，菌絲體得率最高。pH值在靈芝深層發(fā)酵中對靈芝胞外多糖形成有影響，當(dāng)起始pH為5.5時，有利于胞外多糖的形成，發(fā)酵過程中控制pH4.0時，胞外多糖的產(chǎn)量最大。另外，采用正交設(shè)計實(shí)驗(yàn)改變發(fā)酵條件，篩選出靈芝優(yōu)化培養(yǎng)基為:葡萄糖3.6%、蛋白胨0.4%、pH6.0、酵母膏0.2%、KHPO 0.1%、MgSO? 7HO 0.05%、VitB0.005%，每升發(fā)酵液產(chǎn)干菌絲體15.6g，粗多糖0.72g。

1.2灰樹花

灰樹花液體深層培養(yǎng)最適宜的碳源為豆粉+麩皮、氮源為蛋白胨、牛肉膏，pH5.3～6.0，通氣量為1：（1.0～1.4）。發(fā)酵液起始pH為8最適宜，終止pH為3.5，菌絲最適宜生長的pH為5.0。為確定灰樹花深層發(fā)酵的工藝條件，掌握溫度、pH、通氣量、培養(yǎng)基黏度、菌齡及接種量對菌絲體生長的影響，經(jīng)過試驗(yàn)得知，QF培養(yǎng)基，25℃，pH4.5，裝量60mL/500mL三角瓶，轉(zhuǎn)速100r/min,接種量≥12%，種子培養(yǎng)基中加0.4%的CMC,可提高菌絲量。培養(yǎng)基添加生長促進(jìn)劑板栗殼煮汁后，菌絲的增產(chǎn)率達(dá)140%。為進(jìn)一步提高胞外多糖的產(chǎn)量, 重復(fù)利用第一次發(fā)酵后的菌絲體是一種很好的方法。當(dāng)總糖濃度一定時補(bǔ)料可提高胞外多糖的產(chǎn)量，補(bǔ)糖最佳時機(jī)為發(fā)酵84小時后補(bǔ)加葡萄糖,使發(fā)酵液濃度達(dá)5%，可使胞外多糖產(chǎn)量最高達(dá)1.3g/L。菌絲體回收利用次數(shù)以2次為宜。

1.3蜜環(huán)菌

試驗(yàn)中改變蜜環(huán)菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基的碳、氮源濃度，通過測定生長菌絲干重，獲得最適培養(yǎng)基配方為：未脫脂蠶蛹粉1.5%，豆餅粉1.5%，蔗糖2.0%，乙醇1.0%。結(jié)果顯示菌體生物量受氮源影響明顯。以廉價易得的農(nóng)作物產(chǎn)品紅薯粉作為碳源菌絲得率為15.4g/L，NH4Cl作為氮源菌絲得率為13.8g/L。研究發(fā)現(xiàn)液體搖瓶培養(yǎng)過程中，產(chǎn)生色素和香味物質(zhì)的多少與培養(yǎng)基的碳、氮源種類有關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加10%～30%（V/V）的泥炭水解液對蜜環(huán)菌的生物合成有促進(jìn)作用，振蕩培養(yǎng)形成球型菌絲體，靜置液體培養(yǎng)有利于菌索形成。

1.4云芝

人體在正常的生命活動中需要多種微量元素，某些處于無機(jī)態(tài)的微量元素不能被人體直接吸收。利用某些藥用真菌作為載體，通過液體發(fā)酵培養(yǎng)，可以將不能直接吸收的無機(jī)態(tài)轉(zhuǎn)化為有機(jī)態(tài)，成為可直接吸收利用的微量元素。

云芝液體培養(yǎng)富硒的研究解決了這一問題。在云芝的培養(yǎng)基中加入一定濃度的NaSeO，經(jīng)液體培養(yǎng)后，將所得的菌絲進(jìn)行測定，云芝菌絲體中有機(jī)硒含量隨著培養(yǎng)基中添加硒濃度的提高而升高，菌絲體數(shù)量明顯下降。以硒添加量20mg/k為最佳，富集在菌絲體內(nèi)硒的濃度是添加濃度的20倍。制成含硒云芝粉適合人體服用。廢棄的發(fā)酵液還可再用于加進(jìn)固體養(yǎng)料中栽培其它食用菌。

注意到云芝的特性及食用性，在云芝的生產(chǎn)中采用了懸浮培養(yǎng)法，較其栽培法生產(chǎn)周期大大縮短。制成的渾濁汁成品質(zhì)量穩(wěn)定。酸爽柔和，營養(yǎng)豐富，具有云芝獨(dú)特的風(fēng)味和藥理保健作用。

1.5金針菇

通過單因子試驗(yàn)統(tǒng)計分析，篩選出金針菇FV088的適宜培養(yǎng)基和搖瓶培養(yǎng)條件。試驗(yàn)用培養(yǎng)基選用糧食作物，取材方便便于推廣。

在金針菇雜交19號富鋅能力研究中發(fā)現(xiàn)，添加300～2500mg/kg的鋅離子，于26℃，13r/min條件下培養(yǎng)其富鋅能力較好。金針菇的生物富集作用受培養(yǎng)基成分、微量元素濃度的影響，提高培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)、脂肪、鋅的濃度，有利于金針菇對鋅的富集。

1.6羊肚菌

羊肚菌液體搖瓶培養(yǎng)條件及適用培養(yǎng)基的篩選結(jié)果表明，PYG培養(yǎng)基（含0.1%酵母提取物的PDA），適宜的液體培養(yǎng)條件為：25℃，100r/min,裝量100mL三角瓶，pH7.5。另外通過正交試驗(yàn)篩選的搖瓶培養(yǎng)基為麥芽汁50%，玉米粉1.5%，酵母提取物0.5%，蔗糖1.5%。

1.7其它

研究猴頭菌深層發(fā)酵過程中pH值、總糖、還原糖、氨基酸態(tài)氮、菌絲球的數(shù)量、大小等變化，確定了用于配制飲料或營養(yǎng)液的搖瓶培養(yǎng)基及最佳發(fā)酵時間，以4%的葡萄糖為碳源，大豆蛋白胨和酵母粉為氮源或再加0.3%CMC,初始pH為4～5，搖瓶培養(yǎng)8天，發(fā)酵液有猴頭菇的清香味。

分離純化后的野生蛹蟲草斜面菌種，經(jīng)液體培養(yǎng)獲得的菌球，可在米飯培養(yǎng)基上成功地培育出子實(shí)體。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示蛹蟲草胞外多糖的最佳培養(yǎng)基為：玉米粉4%，黃豆粉0.6%，酵母汁0.3%，KHPO 0.05%，MgSO 0.05%，接種量3%，pH5.5。在25℃培養(yǎng)144小時，胞外多糖產(chǎn)量可達(dá)1.83g/L。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)碳源因子對多糖產(chǎn)量影響極顯著，C/N比高，有利于次生代謝物的積累。

冬蟲夏草是名貴的藥用真菌，野生資源被極度采集致使資源愈來愈少，市場貨源緊缺。近年來，應(yīng)用生物技術(shù)發(fā)酵工程，進(jìn)行了冬蟲夏草發(fā)酵生產(chǎn)，其培養(yǎng)基配方為葡萄糖2.5%，蛋白胨0.7%，玉米漿0.5%，酵母粉0.5%，CaCO 0.15%，KHPO 0.15%，pH自然，培養(yǎng)的蟲草菌絲體含甘露醇3.36%，與天然的冬蟲夏草成分相似，用于代替野生冬蟲夏草。

2. 優(yōu)化菌種

為了開拓藥用真菌的生產(chǎn)潛力，提高液體發(fā)酵水平，獲得更多的目的產(chǎn)物，除尋找最佳培養(yǎng)條件外，應(yīng)選育最佳的菌種。在選育優(yōu)質(zhì)菌種時通常采用紫外誘變技術(shù)。

以灰樹花Gr9801為出發(fā)菌株，采用紫外線連續(xù)誘變，經(jīng)分離純化、馴化等方法，以斜面生長速度和液體搖瓶發(fā)酵產(chǎn)多糖總量為監(jiān)測指標(biāo)，篩選出一株遺傳上相對穩(wěn)定的適應(yīng)液體培養(yǎng)的灰樹花菌株-GrUV04，該菌株在綜合PDA培養(yǎng)基上生長速度快，菌體豐滿純白。馴化后在液體培養(yǎng)基中發(fā)酵生長力強(qiáng)，生物量達(dá)1.97%，發(fā)酵多糖總量達(dá)216mg/100mL。分別較出發(fā)菌株提高129.1%和75.6%。對靈芝原生質(zhì)體進(jìn)行了紫外誘變處理，經(jīng)過粗篩和精篩，選出多糖含量明顯高于原始菌株的新品種，經(jīng)過10代的PDA培養(yǎng)基及搖瓶試驗(yàn)和多次3噸罐的中試試驗(yàn)，表明所得的誘變株確實(shí)在產(chǎn)量及多糖含量上超過原來菌株，從小試、中試的結(jié)果看該菌株的性狀比較穩(wěn)定。

3. 分析手段

隨著藥用真菌發(fā)酵技術(shù)的發(fā)展，對發(fā)酵產(chǎn)物的分析手段也不斷提高。在對天然和發(fā)酵培養(yǎng)冬蟲夏草中的腺苷、尿苷、鳥苷等3種核苷類成分的含量的測定中采用了高效毛細(xì)管電泳法。在利用薄層層析法進(jìn)行靈芝有效成分的定性分析中，選用甲苯-乙酸乙酯-乙酸（12：4：0.5）為展開劑，以硫酸-甲醇（1：1）為顯色劑，通過硅膠薄層色譜法由靈芝發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到3種四環(huán)三萜酸，并測定了這3種物質(zhì)的紫外光譜。在云芝菌絲體提取物云芝糖肽中糖和蛋白質(zhì)的含量及分子量測定中采用了快速、分辨率高和重現(xiàn)性好的高效液相凝膠滲透色譜法（HPGPC）。用梯度凝膠法分離電泳比較金針菇液體培養(yǎng)菌絲體與子實(shí)體的同工酶，電泳凝膠精密度掃描圖譜比較表明，菌絲體中SOD同工酶譜帶與子實(shí)體的基本相同。

4. 其它

發(fā)酵產(chǎn)物所含成分十分復(fù)雜，不同提取方法結(jié)果差異很大。對云芝菌株結(jié)合蛋白多糖的分析比較中分別采用了熱水提取、稀堿提取、乙醇沉淀等方法。結(jié)果顯示，水提物多糖含量遠(yuǎn)高于堿提物，堿提物的蛋白含量高于水提物。通過色譜圖顯示，水提物中的組分?jǐn)?shù)比堿提物少，可見水提物中雜質(zhì)少于堿提物。

5. 小結(jié)

藥用真菌液體發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)可以進(jìn)行工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)，其規(guī)模大，產(chǎn)量高、發(fā)酵周期短，具有廣泛的發(fā)展前景。但是在藥用真菌發(fā)酵研究中應(yīng)當(dāng)注意：1.藥用真菌有效成分的研究。發(fā)酵液中所包含的成分極其復(fù)雜，真正有益的成分很難說清。加強(qiáng)這方面的研究可以更準(zhǔn)確把握其作用機(jī)理，以便用于臨床。2.優(yōu)良菌種的選育。應(yīng)選育出適應(yīng)性強(qiáng)，遺傳性狀穩(wěn)定，目的產(chǎn)物得率高的菌種。3.對發(fā)酵設(shè)備和發(fā)酵技術(shù)的改進(jìn)。連續(xù)發(fā)酵設(shè)備和技術(shù)是沿用抗生素生產(chǎn)所用的設(shè)備，有許多需完善之處。4.采用現(xiàn)代化學(xué)分析手段，豐富質(zhì)量鑒定內(nèi)涵。

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