毛木耳多糖對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞蛋白激酶A活性的影響

王道福 邵林萍 鞠保文 丁望

(89醫(yī)院 濰坊261000)

毛木耳多糖(Auricularia polytrica Sacc polysac caride，APSP)系從擔(dān)子菌綱銀耳科毛木耳(Auricularia polytrica Sacc)子實(shí)體中提取，具藥食兩用價(jià)值，有滋補(bǔ)強(qiáng)壯、扶正固本之功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，毛木耳多糖具有免疫增強(qiáng)和抗腫瘤作用，但其作用機(jī)制尚未明確。為進(jìn)一步探討毛木耳多糖的作用機(jī)理，本文采用PLC法，測(cè)定毛木耳多糖均一體組分APSP－A對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(MΦ)PKA活性的影響。

1 材料和方法

1.1 藥品和試劑毛木耳多糖(APSP－A)：按文獻(xiàn)方法提取〔1〕，化學(xué)性質(zhì)屬酸性雜多糖，由甘露糖、葡萄糖、木糖、巖藻糖及少量糠醛酸組成，4種單糖的分子比為320∶10∶018∶005，分子量12萬(wàn)，實(shí)驗(yàn)時(shí)以EPES緩沖液配成所需濃度，濾膜過(guò)濾，消毒，4℃保存。RPMI－1640培養(yǎng)基：Gibco生命技術(shù)公司產(chǎn)品。胎牛血清(FCS)：杭州四季青生物工程公司。EPES緩沖液(p 72～74)、Sucrose、DTT、Leupetin、histone(Ⅲ－s)、PMSF、ATP、ADP、AMP、cAMP均為Sigma產(chǎn)品。甲醇、PiCA，皆為國(guó)產(chǎn)色譜純。

1.2 動(dòng)物：昆明種純系小鼠，♀♂不限，7～8周齡，體重232～255g，由昌濰醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3 巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)：按文獻(xiàn)方法〔2〕無(wú)菌取小鼠腹腔MΦ，經(jīng)苔盼藍(lán)染色細(xì)胞活率90%以上，調(diào)整細(xì)胞濃度為108～109/L，接種于多孔培養(yǎng)板中，置含5%CO2，95%空氣孵箱中，37℃孵育24。對(duì)照組皆以RPMI－1640完全培養(yǎng)基替代，實(shí)驗(yàn)組中加測(cè)試藥物等處理因素皆以RPMI－1640完全培養(yǎng)基溶解和稀釋。

1.4 PKA活性測(cè)定

1.4.1 PKA的制備：按文獻(xiàn)方法[3]操作。

1.4.2 PKA活性測(cè)定：參考文獻(xiàn)[4]以反相離子對(duì)高效液相色譜法測(cè)定〔4〕。色譜條件：C18柱、流動(dòng)相：甲醇：磷酸鹽緩沖液(21∶79V／V，p69，內(nèi)含6mmol/L PiCA)、流速1ml/min、檢測(cè)波長(zhǎng)259nm、柱溫為室溫、0.01AUFS、進(jìn)樣量10～20μl。

1.4.3 蛋白含量測(cè)定：按Lowry法測(cè)定。

1.4.4 PKA活力定義：一個(gè)酶活力單位相當(dāng)于每分鐘使組蛋白istone(Ⅲ－s)磷酸化而消耗1nmol ATP所需的酶量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果以?x±s表示，所有結(jié)果顯著性差異皆以配對(duì)資料t檢驗(yàn)處理。

2結(jié)果

毛木耳多糖對(duì)小鼠MΦ中PKA活性的影響：以80mg/L APSP－A與MΦ一起孵育不同時(shí)間后，測(cè)定PKA總活力。結(jié)果顯示：APSP－A可明顯增強(qiáng)小鼠腹腔MΦ中PKA總活力，8min時(shí)達(dá)到峰值，至20min恢復(fù)到基礎(chǔ)水平(圖1)。在8min時(shí)APSP－A與PKA的量效關(guān)系具有一定濃度依賴(lài)性(r=08958，表1)，實(shí)驗(yàn)測(cè)得PKA的基礎(chǔ)總活力為(9686±688)nmol?min－1?mg－1(n=3，x±s)。

3討論

蛋白激酶是催化體內(nèi)蛋白磷酸化的酶類(lèi)，而蛋白磷酸化則是體內(nèi)各種生物反應(yīng)最終起作用的通路。PKA是一類(lèi)cAMP依賴(lài)性蛋白激酶，是整個(gè)cAMP作用的分子基礎(chǔ)，在真核細(xì)胞內(nèi)幾乎所有cAMP的作用都是通過(guò)活化PKA，從而使底物蛋白發(fā)生磷酸化而實(shí)現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)證明毛木耳多糖可引起小鼠腹腔巨噬細(xì)胞PKA活性明顯升高并具有一定濃度劑量依賴(lài)性，提示其免疫增強(qiáng)作用可能與活化PKA有關(guān)。

參 考 文 獻(xiàn)

1 吳春敏，等毛木耳多糖的分離、分析及免疫藥理活性的研究中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)1991；22(2)：97

2 鄂征主編組織培養(yǎng)技術(shù)北京：人民衛(wèi)生出版社，1993：185

3 李明春，等靈芝多糖對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞蛋白激酶A活性的影響中草藥2000；31(5)：353

4 李明春，等反相離子對(duì)PLC法測(cè)定細(xì)胞中蛋白激酶活性中國(guó)生化藥物雜志1999；20(5)：233