第六節(jié)　　菌種保藏

一、概述

　　蘑菇菌種和其它微生物一樣，都具有穩(wěn)定遺傳性和變異性。遺傳性，保證微生物本身特征的相對穩(wěn)定，即無性繁殖過程中能夠保持原有的性狀，為菌種保藏提供了有利因此，而變異性，使微生物的性狀在繁殖過程中出現(xiàn)某些改變，給菌種保藏帶來了困難。由于存在變異，即菌種常出現(xiàn)所謂的退化，主要指理想性狀的喪失，從而導致發(fā)育緩慢，存活率和產(chǎn)質(zhì)量降低等現(xiàn)象，菌種保藏工作就是使菌種的變異降低至最小水平，使菌種在較長期的保藏之后仍然保持著原有的生命力、優(yōu)良生產(chǎn)性能、形態(tài)特征以及不污染雜菌和發(fā)生蟲害。能夠長期在生產(chǎn)上和研究上應用。

　　微生物的變異速度，通常情況下，與其新陳代謝速度有關(guān)，微生物代謝活力旺盛，它的變異速度快，代謝活動微弱，變異速度就慢。并且在多次的無性繁殖過程中可能會有突變的積累。人們利用這一規(guī)律，可以創(chuàng)造各種條件，使微生物活動處于微弱活動或不活動狀態(tài)，以減少變異的發(fā)生。菌種保藏的原理是：通過低溫、干燥、隔絕空氣和斷絕營養(yǎng)等手段，以達到最大限度地降低菌種的代謝強度，抑制菌絲的生長和繁殖。由于菌種的代謝相對靜止，生命活動將處休眠狀態(tài)，從而可以保藏較長時間。

二、保藏方法

（一）斜面冰箱保藏法

　　這是蘑菇菌種的一種短期保存法，因為它簡單易行，不需特殊設備，并能隨時觀察保藏菌種的情況，因此也是常用的菌種保藏方法。

１、保藏方法　蘑菇菌種斜面冰箱保種一般使用PDA斜面培養(yǎng)基即可。菌種移接后，放在22-24℃溫度下培養(yǎng),要勤檢查,當菌絲健壯地長滿試管時,及時挑選無污染的培養(yǎng)斜面,棉塞用硫酸紙包扎后放置在4℃的冰箱中保藏。一般2-3個月轉(zhuǎn)管一次。

２、注意事項：由于斜面冰箱保藏是在4℃下進行,微生物單孢分離物活動并未停止,需要經(jīng)常轉(zhuǎn)管移接,因此對于保藏所用的斜面菌種質(zhì)量要求較高，其菌絲形態(tài)、菌落特征應保持原有特性，操作人員必須對斜面菌種質(zhì)量應具有有一定的鑒別能力，所挑選的菌種才能適合保藏，其次菌種的菌齡不能太幼也不能太老，否則冰箱保藏后轉(zhuǎn)管擴接易造成退化。再則冰箱溫度應控制在2-4℃之間,盡量恒溫使菌絲體處于穩(wěn)定的生理狀態(tài)。

（二）糞草管冰箱保藏法

１、保藏方法：糞草管的培養(yǎng)基是由腐熟麥稈粉100,腐熟牛糞粉25,麩皮8, 石膏粉1%,碳酸鈣2%,含水量65%左右,pH7.5制備而成,調(diào)配后裝入試管中,經(jīng)高壓滅菌后,接入菌種塊,放在22-24℃溫度下培養(yǎng)。要勤檢查是否有污染，當菌絲健壯地長滿草基試管時，及時挑選生長正常無污染的試管，棉塞頭用硫酸紙包扎后放置在2-4 ℃的冰箱中,該保藏方法為中期保藏，一般2-3年轉(zhuǎn)管一次。

２、注意事項：由于糞草管可保藏2-3年時間,因此如何防止糞草管的水分損失是該保藏方法時間長短的關(guān)鍵所在,一方面培養(yǎng)基含水量不能低于62%, 另一方面棉塞用硫酸紙包扎后可加些蠟進行封口,防止水分蒸發(fā)。 再則有條件應把試管保藏在具有保濕的冰柜或冰庫中，溫度控制在2-4℃,濕度控制在90%左右。

（三）液體石蠟保藏方法

　　液體石蠟防止培養(yǎng)基水分蒸發(fā)，隔絕斜面菌絲與　空氣接觸，抑制菌絲的單孢分離物，可能使其處于休眠狀態(tài)，推遲細胞衰老，延長菌絲的保藏，一般可保藏5-7年，是一種中長期的菌種保藏方法。

１、保藏方法：液蠟保藏蘑菇菌種的培養(yǎng)基為PDA斜面即可。將菌種塊移接到PDA斜面上,在22-24℃下培養(yǎng)15-20天,然后用液體石蠟封藏保存。液體石蠟要選化學純的，在121℃下高壓滅菌30分鐘,再將液體石蠟在160℃烘箱中加熱1-2小時。亦可將高壓滅菌后的液體石蠟放置在40-60℃溫箱中,使滅菌后的液體石蠟層出現(xiàn)乳白色直至變成完全透明的無色為止,目的是將高壓滅菌時侵入液體石蠟中的水蒸發(fā)干凈。 將滅菌除水的液體石蠟用無菌吸管罐到長滿菌絲的斜面試管中，液體石蠟要高出斜面尖端1.0厘米左右，然后用無毒泡沫試管塞塞好，置室溫中保藏。

２、注意事項：菌絲的培養(yǎng)時間不能太短，為防止菌絲體的進一步發(fā)育，可適當延長菌齡或讓試管先置在冰箱中(2-4℃)2天后再加入液體石蠟。倒入的液體石蠟要超過斜面尖端1.0厘米左右,如過低液體石蠟揮發(fā)后會露出斜面, 從而導致斜面培養(yǎng)基的干涸,縮短了保藏時間。烘烤液體石蠟應乇底，盡可能把水分蒸發(fā)干凈， 防止水蒸汽蒸發(fā)導致棉花塞潮濕長霉而影響菌種的保藏。

（四）濾紙保藏法

　　將蘑菇孢子吸附在濾紙條上，干燥后放入冰箱進行保藏，由于該保藏是有性的孢子，一般不用于生產(chǎn)中，主要是起到保藏種質(zhì)資源的作用及菌種的選育，根據(jù)福建省蘑菇菌種研究推廣站的濾紙孢子保藏試驗，用該方法已保藏蘑菇菌種達10年以上,孢子成活率約為50-80%之間。

１、保藏方法：孢子收集方法同單孢子分離的孢子收集，當濾紙條上收到有相當數(shù)量孢子后，用無菌鑷子將濾紙條無菌操作放入無菌試管中，將該試管放在抽真空的干燥器中1-2天,除去濾紙條上水分使之充分干燥,隨后把試管口封好,粘好標簽, 放在冰箱中保藏。

（五）真空冷凍干燥保藏法

　　真空冷凍干燥簡稱凍干。這種方法是利用低溫使孢子先冷凍，然后再在真空條件下，使孢子中的水分升華排出，孢子處于休眠狀態(tài)，但仍保持原有活力，是一種長期保藏蘑菇孢子的保藏方法，具體操作如下。

（１）選用內(nèi)徑8mm,長120mm的中性玻璃管作為制安瓿管的材料。將玻管用2% 鹽酸浸泡8-10小時,再用蒸餾水洗2-3次后,置烘箱中烘干。將印有菌號、編號、 制作日期的標簽放入安瓿管中，塞好棉塞，進行干熱滅菌。

（２）用接種鏟將收集的蘑菇孢子鏟入盛有3ml無菌脫脂牛奶的試管中,稍加搖動, 制成孢子懸浮液。用無菌吸管將孢子懸浮液移入安瓿管的球形部分，每管約0.2ml,然后將管口通過火焰,用無菌鑷子取少許無菌棉花塞于安瓿管口。

（３）將安瓿管放入無水乙醇與干冰混合的凍裝置，溫度可達-65～-70℃預凍5 分鐘左右,也可在低溫冰箱(-40)預凍30-60分鐘。然后取出放入真空干燥器中， 用高真空活塞油封好立即抽真空，并隨時用真空火花檢漏儀檢查真空度，發(fā)現(xiàn)有微小漏氣處，要迅速用真空泥涂住。一般真空度應維持在10.7千帕以下,如抽真空10 分鐘后仍達不到此真空度,說明真空系統(tǒng)不佳,可能會造成融化而失敗。真空干燥器外面用1:3的鹽冰水保溫,其效果會好些,真空度穩(wěn)定,一般抽7-8小時,可完全將安瓿瓶中水升華至干。此時應關(guān)閉緩沖瓶前的三道閥門，然后再斷電。抽干后的安瓿瓶顏色應是白色，如果淺黃色或不成凹狀，多數(shù)都因為真空度達不到要求而造成融化失敗的結(jié)果。

（４）凍干好的安瓿瓶要進行真空熔封。可用一個頂端多歧管或一個Ｚ型管，每個分支口都接入真空橡皮管以便將安瓿管接在橡皮管內(nèi)，然后抽真空，邊抽真空邊用煤氣噴燈熔封。熔封的安瓿　瓶要進行檢漏，可用高真空火花檢漏儀檢查。安瓿瓶內(nèi)呈藍色熒光，說明真空封口良好，也可用微帶紅或藍的清水浸泡安瓿瓶，經(jīng)一晝夜安瓿瓶內(nèi)無顏色水浸入，則為封口合格。

（５）菌種安瓿瓶經(jīng)無菌檢查和存活率檢查合格后，置2-8℃冰箱內(nèi)保藏,一般蘑菇菌種可保藏8-10年。

（６）復蘇培養(yǎng)時，可在開啟的安瓿管內(nèi)注入0.3-0.5ml的無菌生理鹽水或1% 麥芽汁。菌種安瓿瓶開啟時，應先將安瓿瓶的封端加熱，在浸有來蘇爾等消毒液的濕布上擦一下，使管壁形成裂縫，然后再輕輕敲碎。切忌猛烈割斷，以免空氣驟然沖入，導致污染。安瓿瓶加入生理鹽水后菌種即自行溶化，搖動后即成孢子懸浮液，可接入PDA培養(yǎng)基上,進行萌發(fā)培養(yǎng)。

（六）液氮超低溫保藏法

　　液氮超低溫保種是把菌種裝在含有冷凍保護劑的安瓿瓶內(nèi)，將該安瓿瓶放入液氮(-196℃)中進行保藏,由于菌絲體處于-196℃,其代謝降低到完全停止的狀態(tài)。所以不需定期移植。從理論上講，菌絲體可以無限期地存活。蘑菇菌種的液氮保種從1970年開始進行試驗,至今已有20多年的歷史,經(jīng)過大量的試驗證明液氮保種是菌種長期保藏的最有效最可靠的方法。隨著方法的不斷改良，現(xiàn)人介紹近年來應用的一種最簡便的液氮保種方法。

（１）菌種制備　菌種在PDA培養(yǎng)基平板上于22-24℃下培養(yǎng)10-15天,菌絲體充分生長后,用打孔器(直徑2-4mm)打成小孔,或用接種針把菌絲培養(yǎng)物切成2×4mm 長方形小塊。

（２）安瓿管的制備　把直徑4-6mm 的聚乙烯塑料管（也可用飲料吸管）截成小段做成安瓿管。每節(jié)大約60mm長,一頭用熱合機封好。然后用牛皮紙包裝進行121℃下高壓滅菌30分鐘。

（３）保護劑　10%的甘油水溶液進行121℃下高壓滅菌30分鐘可作為冷凍保護劑。用量為每安瓿上留有5-10mm的空間,用無菌注射器從管底注入,以防產(chǎn)生氣泡。隨后，且無菌接種針從安瓿管口放入5-8塊菌種塊，熱合封好安瓿。 用記號筆在發(fā)瓿管外寫上標簽，最后在桌　上用一定的力按　壓，以檢查安瓿是否滲漏。

（４）液氮保藏　把已做好的安瓿菌種管放入具有孔洞的小塑料瓶中（在塑料瓶的底部放一塊鐵片，使塑料瓶連同安瓿管能一起沉入液氮罐中），蓋好瓶蓋，在瓶蓋上連接一條細繩并作記號，以便提出所需的菌種。把裝有安瓿管的塑料瓶吊在液氮罐口上，使安瓿管緩慢地降溫，大約30分鐘后,把 按瓿管浸入液氮中進行長期保存。

（５）恢復培養(yǎng)　如果擬取用液氮保存的菌種，可將安瓿管取出后立即放入35-40℃的溫水中迅速解凍,為了防止污染,用75%酒精洗安瓿管表面,表面干燥后, 用火焰燒過的剪刀在安瓿的一端剪開,用無菌接種針把菌塊移接至PDA培養(yǎng)基上,置22-24℃培養(yǎng)。