高產早熟香菇新品種選育實驗報告
──原生質體技術在食用菌育種中的應用研究之一
中國科學院北京農村經濟技術開發(fā)部 梁枝榮
摘要 栽培用香菇菌株原生質體經UV處理后，進行再生培養(yǎng)選育，篩選出了產量高、出菇早的香菇新品種。
關鍵詞 香菇 原生質體 UV處理 出菇試驗
食用蘑菇菌絲多核、擔孢子壁厚的特點造成誘變育種的困難。通過菌絲原生質體的分離可以將菌絲中的細胞核分離成單個的體細胞，發(fā)育成新的菌株。脫壁后的原生質體對誘變因子的敏感性增強，增加了變異的機會，提高了誘變率。根據(jù)這個原理，我們進行了香菇菌絲原生質體的紫外線誘變育種研究，現(xiàn)將初步結果整理總結如下，供同行參考。
I. 材料和方法
1.1 菌株：Ｌ３８， Ｌ１３，生產中栽培用菌株
1.2. 培養(yǎng)基：見表１
表１ 本實驗中使用的培養(yǎng)基和化學試劑
──────────────────────────────────────
名稱* 組成成分(克/1000毫升)
──────────────────────────────────────
完全培養(yǎng)液(CM)： 硫酸鎂0.5，磷酸二氫鉀0.46， 磷酸氫二鉀1.0，蛋白胨2.0，酵母浸汁2.0， 葡萄糖20.0
完全固體培養(yǎng)基(CMA)： CM加20.0克瓊脂
高滲穩(wěn)定完全培養(yǎng)液(OCM)：CM加0.6克分子量的硫酸鎂
高滲穩(wěn)定液(OSS)： 0.6克分子量硫酸鎂, 0.05克分子量馬來酸, 酸堿度5.8
裂解酶液(ES)： 1.5%裂解酶溶于OSS
──────────────────────────────────────
1.3. 栽培袋培養(yǎng)料：木屑６５％，夫皮２０％，茶葉渣１５％，料水比1:1.6，拌勻裝入直徑１５X３０厘米的聚丙烯袋，每袋裝濕料６５０克，高壓滅菌。
1.4. 原生質體分離
完全培養(yǎng)液內２５度搖床培養(yǎng)７天的香菇菌絲體，用高滲穩(wěn)定液多次沖洗后加入酶液，２５度裂解５小時，玻璃纖維過瀘，瀘液離心收集原生質體，用高滲穩(wěn)定液沖洗兩次。
1.5. 原生質體誘變和雙核再生體的檢出
原生質體稀釋液在黑暗中用紫外線燈以７.５爾格的劑量分別處理０秒、１０秒、１５秒、２０秒和３０秒。處理后的原生質體溶液均勻涂抹于完全高滲培養(yǎng)基平板。黑暗中２５度培養(yǎng)再生１０－１５天，將單個再生菌落轉接到CMA平板，２５度培養(yǎng)５天后，通過顯微鏡觀察檢出雙核再生體。
1.6. 菌絲生長和出菇試驗
從再生菌株和親本菌株菌落上切取直徑0.3厘米的小園片分別轉接入CMA平板中心，每個菌株做５次重復，24度暗光培養(yǎng)，定期觀察，于第21天測量菌落直徑。
再生菌株和親本菌株分別接入栽培袋，每個菌株做５次重復，暗光下２４度培養(yǎng)，定期觀察，于第５５天測量記載菌絲從袋口接種處到菌絲生長前沿長度。６０天菌絲滿袋，脫袋噴水２０度進行轉色出菇培養(yǎng)。現(xiàn)蕾后進行出菇管理，子實體成熟后噴水前采菇稱重，記載統(tǒng)計三潮菇的產量。
II. 結果和討論
2.1 原生質體分離和再生
采用本實驗所用的原生質體分離再生方法，一般可得到５Ｘ１０6擔ml以上的原生質體，再生率在0.3-0.8%之間，原生質體量和再生率可完全滿足實驗所需。
2.2. 雙核菌絲的檢出
再生菌落經顯微鏡觀察，約有１０％左右是單核菌絲，從單個再生菌落中挑選雙核菌絲體轉接入CMA平板，培養(yǎng)成再生菌株，做進一步的研究。
2.3 再生菌株和親本菌株菌絲的生長
如表２所示，２５度培養(yǎng)２１天CMA平板培養(yǎng)基上菌落直徑在2.9-4.6厘米之間， 大部分分布在3.6-4.0厘米之間，其中生長最快的是L38-2， 直徑達到4.6厘米， 生長最慢的是L38-34和L38-55，直徑分別是3.0和2.9厘米；兩株親本菌株的直徑是3.8厘米。 栽培袋內菌絲長度大部分在11.3 和12.2厘米左右， 其中生長最快的是L38-37，菌絲長度達到13厘米， 最慢的是L38-2和L38-6， 菌絲長度分別是10.5和10.3厘米；兩株親本菌株菌絲長度分別是11.5和12.2厘米(表3)。兩種培養(yǎng)基上親本菌株的生長速率均處于中間范圍，結果表明通過原生質體分離誘變得到的再生菌株之間菌絲生長特性有了明顯的分化變異。
表2 CMA平板培養(yǎng)基上再生菌株和親本菌株菌絲的生長速率
───────────────────────────────────────
再生菌株 親本菌株
菌落直徑(CM) 直徑平均值(CM) ─────────── ──────
數(shù)量(株) 比率(%) 數(shù)量(株)
───────────────────────────────────────
2.9-3.0 3.0 6 5.7
3.1-3.5 3.3 3 2.9
3.6-4.0 3.8 30 28.6 2
4.1-4.5 4.3 63 60
4.6 4.6 3 2.9
───────────────────────────────────────
表3 栽培袋內再生菌株和親本菌株菌絲的生長速率
─────────────────────────────────
再生菌株 親本菌株
菌絲長度(CM) 平均值(CM) ────────────── ─────
數(shù)量(株) 比率(%) 數(shù)量(株)
───────────────────────────────────────
9.9 -10.5 10.2 6 5.7
10.6-11.2 10.9 15 14.3
11.3-11.9 11.6 48 45.7 1(L13)
12.0-12.6 12.5 30 28.6 1(L38)
12.7-13.3 13.0 6 5.7
───────────────────────────────────────
2.4. 再生菌株和親本菌株的出菇期與出菇產量
親本菌株的出菇期為44-50天，出菇期最短的６株再生菌株在30-36天之間，而有３株再生菌株出菇期最長為57-63天，兩株親本出菇期在44-50天之間，結果表明通過原生質體分離誘變得到的再生菌株出菇期也出現(xiàn)了較大的分化變異（表4）。
如表5所示，親本菌株的產量在56-127克的范圍內，再生菌株的產量變異幅度較大，其中有６株沒有出菇，而有６株的產量超過親本菌株１倍以上，兩株親本菌株的產量處于平均值略微偏低一點的水平，結果表明，通過原生質體分離誘變可篩選得到產量大幅度提高的變異菌株。
表4 再生菌株和親本菌株的出菇期
───────────────────────────────────────
再生菌株 親本菌株
出菇期(天)* 平均值(天) ───────────────── ──────
數(shù)量(株) 比率(%) 數(shù)量(株)
───────────────────────────────────────
30-36 33 6 5.7
37-43 40 33 33.3
44-50 47 42 40.0 2
51-56 54 15 16.1
57-63 60 3 2.9
───────────────────────────────────────
* 出菇期表示從菌絲滿袋到80%以上的菌袋現(xiàn)蕾
表5 再生菌株和親本菌株出菇產量比較
───────────────────────────────────────
再生菌株 親本菌株
產量(克) 平均值(克) ───────────── ────────
數(shù)量(株) 比率(%) 數(shù)量(株)
───────────────────────────────────────
0 0 6 5.7
10-55 32.5 21 20.0
56-101 78.5 18 17.1 1(L38)
102-147 124.5 21 20.0 1(L13)
146-193 168.5 21 20.0
194-239 214.5 12 11.4
240-285 262.5 6 5.7
───────────────────────────────────────
2.5. 再生菌株產量的穩(wěn)定性
選出兩株產量較高的再生菌株通過組織分離得到下一代，連續(xù)兩代經重復栽培實驗，其高產早熟的特性穩(wěn)定（表6）
表6 再生菌株后代與親本菌株產量出菇期比較
───────────────────────────────────────
產量(克) 出菇期(天)
實驗菌株 ────────────── ─────────────
第一 第二代 第三代 第一代 第二代 第三代
───────────────────────────────────────
親本菌株 L13 110 128 124 46 44 48
再生菌株 L13-4 222 267 249 31 35 32
再生菌株 L13-8 185 241 237 33 30 31
───────────────────────────────────────
III. 小結
本實驗的目的就是以香菇為材料，探討通過原生質體的分離誘變進行食用菌菌種選育的可能性。香菇菌絲原生質體通過不同劑量紫外線的處理，選出了１０５株再生菌株，這些菌株的菌絲生長特性、出菇量、出菇期與它們的原始菌株進行了比較，一些再生菌株獲得了高產早熟的優(yōu)良特性。選出的幾株優(yōu)良菌株經過多次繼代栽培，所獲得的優(yōu)良特性表現(xiàn)穩(wěn)定。結果表明，原生質體分離誘變是一種很有應用價值的食用菌菌種選育方法。（原文地址：http://mycologist.blog.163.com/blog/static/103586098201031201825229/）
──原生質體技術在食用菌育種中的應用研究之一
中國科學院北京農村經濟技術開發(fā)部 梁枝榮
摘要 栽培用香菇菌株原生質體經UV處理后，進行再生培養(yǎng)選育，篩選出了產量高、出菇早的香菇新品種。
關鍵詞 香菇 原生質體 UV處理 出菇試驗
食用蘑菇菌絲多核、擔孢子壁厚的特點造成誘變育種的困難。通過菌絲原生質體的分離可以將菌絲中的細胞核分離成單個的體細胞，發(fā)育成新的菌株。脫壁后的原生質體對誘變因子的敏感性增強，增加了變異的機會，提高了誘變率。根據(jù)這個原理，我們進行了香菇菌絲原生質體的紫外線誘變育種研究，現(xiàn)將初步結果整理總結如下，供同行參考。
I. 材料和方法
1.1 菌株：Ｌ３８， Ｌ１３，生產中栽培用菌株
1.2. 培養(yǎng)基：見表１
表１ 本實驗中使用的培養(yǎng)基和化學試劑
──────────────────────────────────────
名稱* 組成成分(克/1000毫升)
──────────────────────────────────────
完全培養(yǎng)液(CM)： 硫酸鎂0.5，磷酸二氫鉀0.46， 磷酸氫二鉀1.0，蛋白胨2.0，酵母浸汁2.0， 葡萄糖20.0
完全固體培養(yǎng)基(CMA)： CM加20.0克瓊脂
高滲穩(wěn)定完全培養(yǎng)液(OCM)：CM加0.6克分子量的硫酸鎂
高滲穩(wěn)定液(OSS)： 0.6克分子量硫酸鎂, 0.05克分子量馬來酸, 酸堿度5.8
裂解酶液(ES)： 1.5%裂解酶溶于OSS
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1.3. 栽培袋培養(yǎng)料：木屑６５％，夫皮２０％，茶葉渣１５％，料水比1:1.6，拌勻裝入直徑１５X３０厘米的聚丙烯袋，每袋裝濕料６５０克，高壓滅菌。
1.4. 原生質體分離
完全培養(yǎng)液內２５度搖床培養(yǎng)７天的香菇菌絲體，用高滲穩(wěn)定液多次沖洗后加入酶液，２５度裂解５小時，玻璃纖維過瀘，瀘液離心收集原生質體，用高滲穩(wěn)定液沖洗兩次。
1.5. 原生質體誘變和雙核再生體的檢出
原生質體稀釋液在黑暗中用紫外線燈以７.５爾格的劑量分別處理０秒、１０秒、１５秒、２０秒和３０秒。處理后的原生質體溶液均勻涂抹于完全高滲培養(yǎng)基平板。黑暗中２５度培養(yǎng)再生１０－１５天，將單個再生菌落轉接到CMA平板，２５度培養(yǎng)５天后，通過顯微鏡觀察檢出雙核再生體。
1.6. 菌絲生長和出菇試驗
從再生菌株和親本菌株菌落上切取直徑0.3厘米的小園片分別轉接入CMA平板中心，每個菌株做５次重復，24度暗光培養(yǎng)，定期觀察，于第21天測量菌落直徑。
再生菌株和親本菌株分別接入栽培袋，每個菌株做５次重復，暗光下２４度培養(yǎng)，定期觀察，于第５５天測量記載菌絲從袋口接種處到菌絲生長前沿長度。６０天菌絲滿袋，脫袋噴水２０度進行轉色出菇培養(yǎng)。現(xiàn)蕾后進行出菇管理，子實體成熟后噴水前采菇稱重，記載統(tǒng)計三潮菇的產量。
II. 結果和討論
2.1 原生質體分離和再生
采用本實驗所用的原生質體分離再生方法，一般可得到５Ｘ１０6擔ml以上的原生質體，再生率在0.3-0.8%之間，原生質體量和再生率可完全滿足實驗所需。
2.2. 雙核菌絲的檢出
再生菌落經顯微鏡觀察，約有１０％左右是單核菌絲，從單個再生菌落中挑選雙核菌絲體轉接入CMA平板，培養(yǎng)成再生菌株，做進一步的研究。
2.3 再生菌株和親本菌株菌絲的生長
如表２所示，２５度培養(yǎng)２１天CMA平板培養(yǎng)基上菌落直徑在2.9-4.6厘米之間， 大部分分布在3.6-4.0厘米之間，其中生長最快的是L38-2， 直徑達到4.6厘米， 生長最慢的是L38-34和L38-55，直徑分別是3.0和2.9厘米；兩株親本菌株的直徑是3.8厘米。 栽培袋內菌絲長度大部分在11.3 和12.2厘米左右， 其中生長最快的是L38-37，菌絲長度達到13厘米， 最慢的是L38-2和L38-6， 菌絲長度分別是10.5和10.3厘米；兩株親本菌株菌絲長度分別是11.5和12.2厘米(表3)。兩種培養(yǎng)基上親本菌株的生長速率均處于中間范圍，結果表明通過原生質體分離誘變得到的再生菌株之間菌絲生長特性有了明顯的分化變異。
表2 CMA平板培養(yǎng)基上再生菌株和親本菌株菌絲的生長速率
───────────────────────────────────────
再生菌株 親本菌株
菌落直徑(CM) 直徑平均值(CM) ─────────── ──────
數(shù)量(株) 比率(%) 數(shù)量(株)
───────────────────────────────────────
2.9-3.0 3.0 6 5.7
3.1-3.5 3.3 3 2.9
3.6-4.0 3.8 30 28.6 2
4.1-4.5 4.3 63 60
4.6 4.6 3 2.9
───────────────────────────────────────
表3 栽培袋內再生菌株和親本菌株菌絲的生長速率
─────────────────────────────────
再生菌株 親本菌株
菌絲長度(CM) 平均值(CM) ────────────── ─────
數(shù)量(株) 比率(%) 數(shù)量(株)
───────────────────────────────────────
9.9 -10.5 10.2 6 5.7
10.6-11.2 10.9 15 14.3
11.3-11.9 11.6 48 45.7 1(L13)
12.0-12.6 12.5 30 28.6 1(L38)
12.7-13.3 13.0 6 5.7
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2.4. 再生菌株和親本菌株的出菇期與出菇產量
親本菌株的出菇期為44-50天，出菇期最短的６株再生菌株在30-36天之間，而有３株再生菌株出菇期最長為57-63天，兩株親本出菇期在44-50天之間，結果表明通過原生質體分離誘變得到的再生菌株出菇期也出現(xiàn)了較大的分化變異（表4）。
如表5所示，親本菌株的產量在56-127克的范圍內，再生菌株的產量變異幅度較大，其中有６株沒有出菇，而有６株的產量超過親本菌株１倍以上，兩株親本菌株的產量處于平均值略微偏低一點的水平，結果表明，通過原生質體分離誘變可篩選得到產量大幅度提高的變異菌株。
表4 再生菌株和親本菌株的出菇期
───────────────────────────────────────
再生菌株 親本菌株
出菇期(天)* 平均值(天) ───────────────── ──────
數(shù)量(株) 比率(%) 數(shù)量(株)
───────────────────────────────────────
30-36 33 6 5.7
37-43 40 33 33.3
44-50 47 42 40.0 2
51-56 54 15 16.1
57-63 60 3 2.9
───────────────────────────────────────
* 出菇期表示從菌絲滿袋到80%以上的菌袋現(xiàn)蕾
表5 再生菌株和親本菌株出菇產量比較
───────────────────────────────────────
再生菌株 親本菌株
產量(克) 平均值(克) ───────────── ────────
數(shù)量(株) 比率(%) 數(shù)量(株)
───────────────────────────────────────
0 0 6 5.7
10-55 32.5 21 20.0
56-101 78.5 18 17.1 1(L38)
102-147 124.5 21 20.0 1(L13)
146-193 168.5 21 20.0
194-239 214.5 12 11.4
240-285 262.5 6 5.7
───────────────────────────────────────
2.5. 再生菌株產量的穩(wěn)定性
選出兩株產量較高的再生菌株通過組織分離得到下一代，連續(xù)兩代經重復栽培實驗，其高產早熟的特性穩(wěn)定（表6）
表6 再生菌株后代與親本菌株產量出菇期比較
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產量(克) 出菇期(天)
實驗菌株 ────────────── ─────────────
第一 第二代 第三代 第一代 第二代 第三代
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親本菌株 L13 110 128 124 46 44 48
再生菌株 L13-4 222 267 249 31 35 32
再生菌株 L13-8 185 241 237 33 30 31
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III. 小結
本實驗的目的就是以香菇為材料，探討通過原生質體的分離誘變進行食用菌菌種選育的可能性。香菇菌絲原生質體通過不同劑量紫外線的處理，選出了１０５株再生菌株，這些菌株的菌絲生長特性、出菇量、出菇期與它們的原始菌株進行了比較，一些再生菌株獲得了高產早熟的優(yōu)良特性。選出的幾株優(yōu)良菌株經過多次繼代栽培，所獲得的優(yōu)良特性表現(xiàn)穩(wěn)定。結果表明，原生質體分離誘變是一種很有應用價值的食用菌菌種選育方法。（原文地址：http://mycologist.blog.163.com/blog/static/103586098201031201825229/）
