《現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技》 2008年第08期 作者：武模戈
摘要 利用拮抗試驗(yàn)、同工酶技術(shù)以及菌絲平板培養(yǎng)研究了14個(gè)平菇菌株的親緣關(guān)系和培養(yǎng)特性。對(duì)親緣關(guān)系研究的結(jié)果表明：14個(gè)栽培菌株分別屬于4個(gè)品種，其中P1、P2、P5 親緣關(guān)系較近，無拮抗反應(yīng)，屬同種異名；P3、P6、P11親緣關(guān)系較近，無拮抗反應(yīng)，屬同種異名；P7、P8、P9、P10、P12、P13、P14親緣關(guān)系較近，無拮抗反應(yīng)，屬同種異名；P4與所有供試菌株都發(fā)生拮抗反應(yīng)，為獨(dú)立品種。菌絲培養(yǎng)結(jié)果表明：P11生長(zhǎng)速度最快，平均生長(zhǎng)速度達(dá)到5.19mm/d，其次是P7、P6，分別為5.04mm/d和4.96mm/d，與其他菌株的差異達(dá)到極顯著水平；P9最慢，平均生長(zhǎng)速度達(dá)到2.23mm/d；P13、P8的生長(zhǎng)速度分別為2.30mm/d和2.53mm/d，與其他菌株的差異也達(dá)到顯著水平。綜合不同菌株菌絲的生長(zhǎng)速度和生長(zhǎng)勢(shì)，潛在的優(yōu)良品種初步確定為P11、P7、P6、P14、P1和P10。
關(guān)鍵詞 平菇；拮抗反應(yīng)；酯酶同工酶；電泳；生長(zhǎng)速度；生長(zhǎng)勢(shì)
中圖分類號(hào) S646.1+4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)1007-5739（2008）08-0005-03
平菇（Pleurotus ostreatus）在分類學(xué)上屬于真菌門、擔(dān)子菌亞門、層菌綱、傘菌目、側(cè)耳科、側(cè)耳屬[1]。全世界約有50種，我國(guó)是側(cè)耳屬真菌種類資源較為豐富的國(guó)家之一[2]。由于我國(guó)菌種管理制度不完善，加之管理力度不夠，目前菌種生產(chǎn)、銷售比較混亂。在大量的推廣菌株中，存在著嚴(yán)重的同種異名現(xiàn)象，品種質(zhì)量參差不齊[3]。菌種管理混亂給菇農(nóng)引種和研究單位進(jìn)行育種研究帶來諸多不便，制約了平菇生產(chǎn)的健康發(fā)展。對(duì)在我省大面積推廣的14個(gè)平菇菌株進(jìn)行了拮抗試驗(yàn)、菌絲培養(yǎng)特性試驗(yàn)和出菇試驗(yàn)，以明確各菌株間的親緣關(guān)系，選出適宜于本地區(qū)栽培平菇優(yōu)良菌株，同時(shí)為今后進(jìn)行雜交育種時(shí)親本的選擇奠定基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1供試菌株。供試菌株及其來源見表1。
1.1.2儀器與設(shè)備。BCM-1000生物潔凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司制造）、101-1-BS恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠制造）、SPX-250型生化恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠制造）、電爐（上海中航五金機(jī)械廠制造）、培養(yǎng)皿（西安延河玻璃儀器廠制造）、試管、培養(yǎng)皿、接種鉤、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、酒精燈、玻璃板、鐵夾、注射器、電泳儀、電泳槽、有機(jī)玻璃條、容量瓶、試劑瓶、燒杯、移液管、吸耳球、滴管、玻璃圓盤、電冰箱、酸度計(jì)等。
1.1.3供試培養(yǎng)基。綜合PDA培養(yǎng)基：配方為馬鈴薯（去皮）200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、KH2PO4 3g、MgSO4·7H2O 1.5g、蒸餾水1 000mL，pH值自然。液體PD培養(yǎng)基：水1 000 mL、馬鈴薯（去皮）200g、葡萄糖20g、磷酸二氫鉀3g、硫酸鎂1.5g。
1.2方法
1.2.1菌種活化與同步。將供試菌株在母種培養(yǎng)基上活化，再將活化后的菌種接種到綜合PDA培養(yǎng)基上平板中央，在25℃恒溫條件下培養(yǎng)7d，以保證后期試驗(yàn)中菌齡和接種量一致，減少試驗(yàn)誤差。
1.2.2拮抗試驗(yàn)[4]。將14個(gè)供試菌株中的任意2個(gè)菌株配對(duì)組合，進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)，分別接種于綜合PDA平板上，每皿接2個(gè)菌株，菌種塊相距2.5cm，置25℃恒溫箱中培養(yǎng)，觀察有無拮抗反應(yīng)。
1.2.3菌絲培養(yǎng)特性試驗(yàn)。將綜合PDA培養(yǎng)基在微波爐中溶化，倒平板，在無菌條件下進(jìn)行接種。接種時(shí)用直徑6mm的打孔器沿活化后的菌種菌落邊緣取相同菌齡的菌種塊，分別接種在平板培養(yǎng)基中央，每皿接直徑6mm的菌種1塊，菌絲面朝上，輕壓以防止滑動(dòng)。每個(gè)品種設(shè)3個(gè)重復(fù)。接種后置于25℃的恒溫箱中培養(yǎng)。觀察菌絲生長(zhǎng)情況，當(dāng)生長(zhǎng)速度最快的菌株即將長(zhǎng)滿平板時(shí)取出，觀察比較菌絲生長(zhǎng)勢(shì)，測(cè)定菌落直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速度[6]。
菌絲生長(zhǎng)速度（mm/d）=（平均菌落直徑-6）/（菌絲培養(yǎng)天數(shù)×2）
1.2.4同工酶電泳[5-6]。同工酶是指具有相同或相似的催化功能但酶分子的結(jié)構(gòu)卻不同的一組酶，一般認(rèn)為同工酶是由染色體上不同的等位基因或不同基因座位編碼的，它所表達(dá)的信息是分子水平上的信息。同工酶分析作為分子遺傳標(biāo)記技術(shù)之一，不僅被廣泛用于動(dòng)植物的遺傳分析、生理生化研究，而且被作為化學(xué)分類的重要指標(biāo)引進(jìn)真菌的分類鑒定研究中，它彌補(bǔ)了菌落形態(tài)與顏色、孢子形態(tài)、子實(shí)體形態(tài)等特征傳統(tǒng)真菌分類的不足，且簡(jiǎn)單易行，已逐漸成為該領(lǐng)域常用而重要的工具，特別是在屬內(nèi)種間以及品種之間的分類鑒定中是非常有效的。近年來，許多學(xué)者在利用同工酶技術(shù)進(jìn)行食用菌育種和遺傳分析上作了大量工作，本試驗(yàn)應(yīng)用同工酶技術(shù)研究平菇14個(gè)菌株的酯酶酶譜相似性和差異性，并對(duì)14個(gè)菌株進(jìn)行親緣關(guān)系分析，為平菇分類、育種和平菇優(yōu)劣的鑒定提供分子水平的依據(jù)。
1.2.4.1平菇菌絲液體培養(yǎng)。將活化后生長(zhǎng)旺盛的菌絲分別接種于250mL裝有80mL無菌PD液體培養(yǎng)基的三角瓶?jī)?nèi)，25℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)7d，形成球狀菌絲團(tuán)。
1.2.4.2酶提取液的制備。從上述三角瓶中濾出菌絲，用蒸餾水沖洗2～3次，洗凈其上培養(yǎng)基，離心，吸干水分，放入無菌的培養(yǎng)皿冰箱內(nèi)冷凍24h后，加入與菌絲等重量的0.1 mol/L TBE緩沖液在冰浴上用研缽充分研磨菌絲成糊狀，在10 000rpm條件下離心10min，取上清液，加入少量甘油置冰箱內(nèi)4℃保存?zhèn)溆谩?
1.2.4.3電泳[7]。電泳最好在4℃左右進(jìn)行，這樣一方面可以防止電泳發(fā)熱影響酶活力，另一方面可防止膠面斷裂等問題發(fā)生。采用垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠濃度7.5%，pH值8.9；濃縮膠濃度3%，pH值6.7；電極緩沖液為Tris-Gly系統(tǒng)，pH值8.3，點(diǎn)樣量0.02mL，電泳指示劑為溴酚藍(lán)，開始電泳采用100V的電壓，待溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后，加大電壓至160V，當(dāng)溴酚藍(lán)距膠板底部1cm時(shí)，停止電泳。電泳結(jié)束后，取下膠板，放入酯酶染色液中，37℃下染色30min，待顯出清晰酶帶后取出，用蒸餾水漂洗數(shù)次，用7%醋酸固定脫色后，進(jìn)行拍照并進(jìn)行酶譜分析。
（1）制板。將玻璃板先用肥皂洗凈，再用酒精擦1遍，晾干后待用。
?。?）分離膠灌膠。將配制好的分離膠倒入固定好的玻璃板中，灌至距玻璃板凹槽3cm處，注入蒸餾水壓平膠面。凝固大約30min。
?。?）隔層膠灌膠。待分離膠凝固，與蒸餾水之間形成1條清楚的界面。將水倒出，用濾紙吸去多余的水，將配制好的隔層膠溶液倒入玻璃板，離凹槽3mm處，插入試樣格，防止產(chǎn)生氣泡。凝固大約40min。
?。?）去試樣格。兩手拇指扣住試樣格的柄，兩手的食指和中指分別壓住玻璃板的邊緣，慢慢取出試樣格。用濾紙吸去樣品槽中多余的水分。去掉底部的有機(jī)玻璃條，吸去多余的水分。
?。?）裝板。用鐵夾將玻璃板固定在電泳槽上，向電泳槽的下槽倒入電泳緩沖液，趕走氣泡。用藍(lán)色記號(hào)筆標(biāo)記加樣品的位置，記好順序。
（6）加樣。在相應(yīng)的試樣槽中，加入20μL樣品、5mL 0.2％的溴酚藍(lán)指示劑和5mL的電泳緩沖液。
（7）電泳。在4℃條件下，以160V的電壓、15A的電流進(jìn)行電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)距膠板底部1cm時(shí)，停止電泳。
摘要 利用拮抗試驗(yàn)、同工酶技術(shù)以及菌絲平板培養(yǎng)研究了14個(gè)平菇菌株的親緣關(guān)系和培養(yǎng)特性。對(duì)親緣關(guān)系研究的結(jié)果表明：14個(gè)栽培菌株分別屬于4個(gè)品種，其中P1、P2、P5 親緣關(guān)系較近，無拮抗反應(yīng)，屬同種異名；P3、P6、P11親緣關(guān)系較近，無拮抗反應(yīng)，屬同種異名；P7、P8、P9、P10、P12、P13、P14親緣關(guān)系較近，無拮抗反應(yīng)，屬同種異名；P4與所有供試菌株都發(fā)生拮抗反應(yīng)，為獨(dú)立品種。菌絲培養(yǎng)結(jié)果表明：P11生長(zhǎng)速度最快，平均生長(zhǎng)速度達(dá)到5.19mm/d，其次是P7、P6，分別為5.04mm/d和4.96mm/d，與其他菌株的差異達(dá)到極顯著水平；P9最慢，平均生長(zhǎng)速度達(dá)到2.23mm/d；P13、P8的生長(zhǎng)速度分別為2.30mm/d和2.53mm/d，與其他菌株的差異也達(dá)到顯著水平。綜合不同菌株菌絲的生長(zhǎng)速度和生長(zhǎng)勢(shì)，潛在的優(yōu)良品種初步確定為P11、P7、P6、P14、P1和P10。
關(guān)鍵詞 平菇；拮抗反應(yīng)；酯酶同工酶；電泳；生長(zhǎng)速度；生長(zhǎng)勢(shì)
中圖分類號(hào) S646.1+4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)1007-5739（2008）08-0005-03
平菇（Pleurotus ostreatus）在分類學(xué)上屬于真菌門、擔(dān)子菌亞門、層菌綱、傘菌目、側(cè)耳科、側(cè)耳屬[1]。全世界約有50種，我國(guó)是側(cè)耳屬真菌種類資源較為豐富的國(guó)家之一[2]。由于我國(guó)菌種管理制度不完善，加之管理力度不夠，目前菌種生產(chǎn)、銷售比較混亂。在大量的推廣菌株中，存在著嚴(yán)重的同種異名現(xiàn)象，品種質(zhì)量參差不齊[3]。菌種管理混亂給菇農(nóng)引種和研究單位進(jìn)行育種研究帶來諸多不便，制約了平菇生產(chǎn)的健康發(fā)展。對(duì)在我省大面積推廣的14個(gè)平菇菌株進(jìn)行了拮抗試驗(yàn)、菌絲培養(yǎng)特性試驗(yàn)和出菇試驗(yàn)，以明確各菌株間的親緣關(guān)系，選出適宜于本地區(qū)栽培平菇優(yōu)良菌株，同時(shí)為今后進(jìn)行雜交育種時(shí)親本的選擇奠定基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1供試菌株。供試菌株及其來源見表1。
1.1.2儀器與設(shè)備。BCM-1000生物潔凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司制造）、101-1-BS恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠制造）、SPX-250型生化恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠制造）、電爐（上海中航五金機(jī)械廠制造）、培養(yǎng)皿（西安延河玻璃儀器廠制造）、試管、培養(yǎng)皿、接種鉤、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、酒精燈、玻璃板、鐵夾、注射器、電泳儀、電泳槽、有機(jī)玻璃條、容量瓶、試劑瓶、燒杯、移液管、吸耳球、滴管、玻璃圓盤、電冰箱、酸度計(jì)等。
1.1.3供試培養(yǎng)基。綜合PDA培養(yǎng)基：配方為馬鈴薯（去皮）200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、KH2PO4 3g、MgSO4·7H2O 1.5g、蒸餾水1 000mL，pH值自然。液體PD培養(yǎng)基：水1 000 mL、馬鈴薯（去皮）200g、葡萄糖20g、磷酸二氫鉀3g、硫酸鎂1.5g。
1.2方法
1.2.1菌種活化與同步。將供試菌株在母種培養(yǎng)基上活化，再將活化后的菌種接種到綜合PDA培養(yǎng)基上平板中央，在25℃恒溫條件下培養(yǎng)7d，以保證后期試驗(yàn)中菌齡和接種量一致，減少試驗(yàn)誤差。
1.2.2拮抗試驗(yàn)[4]。將14個(gè)供試菌株中的任意2個(gè)菌株配對(duì)組合，進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)，分別接種于綜合PDA平板上，每皿接2個(gè)菌株，菌種塊相距2.5cm，置25℃恒溫箱中培養(yǎng)，觀察有無拮抗反應(yīng)。
1.2.3菌絲培養(yǎng)特性試驗(yàn)。將綜合PDA培養(yǎng)基在微波爐中溶化，倒平板，在無菌條件下進(jìn)行接種。接種時(shí)用直徑6mm的打孔器沿活化后的菌種菌落邊緣取相同菌齡的菌種塊，分別接種在平板培養(yǎng)基中央，每皿接直徑6mm的菌種1塊，菌絲面朝上，輕壓以防止滑動(dòng)。每個(gè)品種設(shè)3個(gè)重復(fù)。接種后置于25℃的恒溫箱中培養(yǎng)。觀察菌絲生長(zhǎng)情況，當(dāng)生長(zhǎng)速度最快的菌株即將長(zhǎng)滿平板時(shí)取出，觀察比較菌絲生長(zhǎng)勢(shì)，測(cè)定菌落直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速度[6]。
菌絲生長(zhǎng)速度（mm/d）=（平均菌落直徑-6）/（菌絲培養(yǎng)天數(shù)×2）
1.2.4同工酶電泳[5-6]。同工酶是指具有相同或相似的催化功能但酶分子的結(jié)構(gòu)卻不同的一組酶，一般認(rèn)為同工酶是由染色體上不同的等位基因或不同基因座位編碼的，它所表達(dá)的信息是分子水平上的信息。同工酶分析作為分子遺傳標(biāo)記技術(shù)之一，不僅被廣泛用于動(dòng)植物的遺傳分析、生理生化研究，而且被作為化學(xué)分類的重要指標(biāo)引進(jìn)真菌的分類鑒定研究中，它彌補(bǔ)了菌落形態(tài)與顏色、孢子形態(tài)、子實(shí)體形態(tài)等特征傳統(tǒng)真菌分類的不足，且簡(jiǎn)單易行，已逐漸成為該領(lǐng)域常用而重要的工具，特別是在屬內(nèi)種間以及品種之間的分類鑒定中是非常有效的。近年來，許多學(xué)者在利用同工酶技術(shù)進(jìn)行食用菌育種和遺傳分析上作了大量工作，本試驗(yàn)應(yīng)用同工酶技術(shù)研究平菇14個(gè)菌株的酯酶酶譜相似性和差異性，并對(duì)14個(gè)菌株進(jìn)行親緣關(guān)系分析，為平菇分類、育種和平菇優(yōu)劣的鑒定提供分子水平的依據(jù)。
1.2.4.1平菇菌絲液體培養(yǎng)。將活化后生長(zhǎng)旺盛的菌絲分別接種于250mL裝有80mL無菌PD液體培養(yǎng)基的三角瓶?jī)?nèi)，25℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)7d，形成球狀菌絲團(tuán)。
1.2.4.2酶提取液的制備。從上述三角瓶中濾出菌絲，用蒸餾水沖洗2～3次，洗凈其上培養(yǎng)基，離心，吸干水分，放入無菌的培養(yǎng)皿冰箱內(nèi)冷凍24h后，加入與菌絲等重量的0.1 mol/L TBE緩沖液在冰浴上用研缽充分研磨菌絲成糊狀，在10 000rpm條件下離心10min，取上清液，加入少量甘油置冰箱內(nèi)4℃保存?zhèn)溆谩?
1.2.4.3電泳[7]。電泳最好在4℃左右進(jìn)行，這樣一方面可以防止電泳發(fā)熱影響酶活力，另一方面可防止膠面斷裂等問題發(fā)生。采用垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠濃度7.5%，pH值8.9；濃縮膠濃度3%，pH值6.7；電極緩沖液為Tris-Gly系統(tǒng)，pH值8.3，點(diǎn)樣量0.02mL，電泳指示劑為溴酚藍(lán)，開始電泳采用100V的電壓，待溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后，加大電壓至160V，當(dāng)溴酚藍(lán)距膠板底部1cm時(shí)，停止電泳。電泳結(jié)束后，取下膠板，放入酯酶染色液中，37℃下染色30min，待顯出清晰酶帶后取出，用蒸餾水漂洗數(shù)次，用7%醋酸固定脫色后，進(jìn)行拍照并進(jìn)行酶譜分析。
（1）制板。將玻璃板先用肥皂洗凈，再用酒精擦1遍，晾干后待用。
?。?）分離膠灌膠。將配制好的分離膠倒入固定好的玻璃板中，灌至距玻璃板凹槽3cm處，注入蒸餾水壓平膠面。凝固大約30min。
?。?）隔層膠灌膠。待分離膠凝固，與蒸餾水之間形成1條清楚的界面。將水倒出，用濾紙吸去多余的水，將配制好的隔層膠溶液倒入玻璃板，離凹槽3mm處，插入試樣格，防止產(chǎn)生氣泡。凝固大約40min。
?。?）去試樣格。兩手拇指扣住試樣格的柄，兩手的食指和中指分別壓住玻璃板的邊緣，慢慢取出試樣格。用濾紙吸去樣品槽中多余的水分。去掉底部的有機(jī)玻璃條，吸去多余的水分。
?。?）裝板。用鐵夾將玻璃板固定在電泳槽上，向電泳槽的下槽倒入電泳緩沖液，趕走氣泡。用藍(lán)色記號(hào)筆標(biāo)記加樣品的位置，記好順序。
（6）加樣。在相應(yīng)的試樣槽中，加入20μL樣品、5mL 0.2％的溴酚藍(lán)指示劑和5mL的電泳緩沖液。
（7）電泳。在4℃條件下，以160V的電壓、15A的電流進(jìn)行電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)距膠板底部1cm時(shí)，停止電泳。
