利用可以在人工條件完成整個(gè)生活史的蛹蟲草菌種,分離、鑒定了2個(gè)蛹蟲草菌株子囊孢子的單孢分離物,對(duì)子囊單孢的配對(duì)培養(yǎng)和子實(shí)體誘導(dǎo)結(jié)果顯示,蛹蟲草具有典型的二極性異宗配合習(xí)性。
子囊菌;A蛹蟲草;A交配型;A異宗配合
蛹蟲草[Cordyceps militaris (L.) Link]又名北冬蟲夏草,分類學(xué)上屬真菌門(Eumycota),子囊菌亞門(Ascomycotina),核菌綱(Pyrenomycetes),球殼目(Sphaeriales),麥角菌科(Clavicepitaceae),蟲草屬(Cordyceps)[1]。蟲草屬真菌是一類具有重要藥用和開(kāi)發(fā)價(jià)值的真菌,其中冬蟲夏草[Cordyceps sinensis (Berk.)Sacc.]為我國(guó)傳統(tǒng)名貴滋補(bǔ)中藥材,由于野生資源稀少,價(jià)格極其昂貴,許多科研單位對(duì)其子實(shí)體人工培養(yǎng)進(jìn)行了大量的研究工作,但至今尚未能規(guī)模培養(yǎng)[2~7]。蛹蟲草作為蟲草屬真菌的模式種,具有與冬蟲夏草相似的藥理功效,且人工規(guī)模培養(yǎng)已經(jīng)成功,正逐漸成為冬蟲夏草的重要替代品,具有廣闊的市場(chǎng)前景。目前有關(guān)蛹蟲草的研究,主要集中于培養(yǎng)條件選擇、有效成分分析和藥理作用研究上[8~20],對(duì)其基本生物學(xué)、遺傳學(xué)等方面的研究仍較薄弱[21~24],對(duì)其交配型的研究幾為空白[25]。
真菌的交配型是控制其交配親和性和有性生殖的遺傳基礎(chǔ)。已知真菌的交配型系統(tǒng)分為同宗配合和異宗配合2大類。同宗配合是一種自體可孕的有性生殖方式,即該真菌不需要兩個(gè)不同來(lái)源的菌絲交配,只由同一有性孢子萌發(fā)生成的初級(jí)菌絲就可獨(dú)立完成有性生活史。同宗配合分成初級(jí)同宗配合(primary homothallism)和次級(jí)同宗配合(secondary homothallism)。異宗配合是一種自體不孕的有性生殖方式,即由同一有性孢子萌發(fā)形成的初級(jí)菌絲不能獨(dú)立完成有性生活史,只有通過(guò)兩個(gè)不同交配型的有性孢子萌發(fā)生成的初生菌絲之間的交配,才能完成有性生活史。異宗配合根據(jù)控制交配型的不親和性因子是一對(duì)還是兩對(duì),也可分為兩類:具有一對(duì)不親和性因子的二極性異宗配合(bipolar heterothallism)和具有兩對(duì)不親和性因子的四極性異宗配合(tetrapolar heterothallism)。就同一菌株所產(chǎn)生的有性孢子間的交配而言,二極性異宗配合菌的可親和率為50%,而四極性異宗配合菌的可親和率為25%,這是判斷是否二極性或四極性異宗配合的基本依據(jù)。在已研究的擔(dān)子菌中,約有90%的種屬于異宗配合真菌,其中,約有25%為二極性異宗配合真菌,75%為四極性異宗配合真菌[26,27]。而對(duì)子囊菌,現(xiàn)有報(bào)道種類中同宗配合占較大比例[27],但研究較多的粗糙脈孢菌(Neurospora crrassa)則為典型的二極性異宗配合真菌(A, a)[28] ;由于缺少像擔(dān)子菌中的鎖狀聯(lián)合一樣的簡(jiǎn)易判斷標(biāo)準(zhǔn),子囊菌關(guān)于交配型的研究比較困難而且報(bào)道較少。本文利用能在人工條件下完成全部生活史、并能較容易地分離到子囊孢子單孢的蛹蟲草菌種,率先進(jìn)行了其交配特性的研究,旨在豐富對(duì)子囊菌的交配特性的認(rèn)識(shí),為蟲草屬內(nèi)不同真菌的交配特性研究提供參考。
1 材料與方法
1.1κ匝椴牧
實(shí)驗(yàn)所用的2個(gè)蛹蟲草菌株C.m.H-07ZY1和C.m.H-04G13s9均采自長(zhǎng)白山區(qū),為本實(shí)驗(yàn)室在大量分離純化和篩選基礎(chǔ)上獲得的能成功培養(yǎng)出正常子實(shí)體的菌株。
1.2ε嘌基
PDA培養(yǎng)基:土豆200 g(煮汁),葡萄糖20 g,瓊脂20 g,水1000 mL,用于菌種分離和保存;
PDB培養(yǎng)基:土豆200 g(煮汁),葡萄糖20 g,水1000 mL,用菌種液體培養(yǎng);
米飯培養(yǎng)基:25 g大米加35 g水,高壓滅菌后作為子實(shí)體培養(yǎng)基。
高新華:蛹蟲草(Cordyceps militaris)的交配型研究
1.3ψ郵堤迦斯づ嘌方法
將在PDA斜面活化的蛹蟲草菌種接種于PDB液體培養(yǎng)基中(75 mL/250 mL),轉(zhuǎn)速150 rpm、25 ℃下振蕩培養(yǎng)3 d,再將所得的液體菌種稀釋(約100倍)轉(zhuǎn)接于瓶裝米飯培養(yǎng)基上(4 mL/瓶),瓶蓋中墊上濾紙,以避免空氣交換可能引發(fā)的污染,于25 ℃暗培養(yǎng)3~4 d,當(dāng)觀察到菌絲已明顯在培養(yǎng)基表面開(kāi)始蔓延時(shí),轉(zhuǎn)至光培養(yǎng)室,光照強(qiáng)度以室內(nèi)散射光為準(zhǔn),培養(yǎng)溫度調(diào)至22 ℃。培養(yǎng)18 d左右,子實(shí)體原基開(kāi)始出現(xiàn),50~55 d左右,子實(shí)體成熟并開(kāi)始彈射子囊孢子。
1.4ψ幽益咦擁ユ叻擲
取蛹蟲草成熟子座,倒置固定于不相接觸的PDA培養(yǎng)基上方,使子囊孢子可以彈射到培養(yǎng)基平板上。22 ℃恒溫培養(yǎng)2~3 d后,分別挑取子囊單孢菌落轉(zhuǎn)接至PDA斜面上,22 ℃恒溫培養(yǎng),待菌絲長(zhǎng)滿斜面后保存?zhèn)溆谩?
1.5ψ幽業(yè)ユ叻擲刖株的配對(duì)及子實(shí)體誘導(dǎo)
將分離得到的單孢菌絲轉(zhuǎn)接于PDB液體培養(yǎng)基中25 ℃振蕩培養(yǎng)3~5 d,將所得液體單孢菌種單獨(dú)接種于米飯培養(yǎng)基上培養(yǎng)以誘導(dǎo)產(chǎn)子實(shí)體,即為單孢培養(yǎng)產(chǎn)子實(shí)體試驗(yàn);將所得液體單孢菌種兩兩配對(duì)混合后接種于米飯培養(yǎng)基上培養(yǎng)以誘導(dǎo)產(chǎn)子實(shí)體,即為配對(duì)培養(yǎng)產(chǎn)子實(shí)體試驗(yàn)。每個(gè)培養(yǎng)樣品10個(gè)重復(fù),子實(shí)體誘導(dǎo)培養(yǎng)方法如1.3中所述。
1.6ν核體和異核體的鑒定
從單孢菌株的培養(yǎng)和配對(duì)結(jié)果看,單孢分離菌株與親本菌株菌絲生長(zhǎng)無(wú)明顯差異,菌株之間也沒(méi)有明顯形態(tài)方面的差異,結(jié)合子實(shí)體誘導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)果,本實(shí)驗(yàn)將菌株是否能形成子實(shí)體作為區(qū)分同核體和異核體的標(biāo)準(zhǔn),即正常條件下不能形成子實(shí)體的單孢分離株為單核的單孢分離株,而產(chǎn)生子實(shí)體的則不是。以此標(biāo)準(zhǔn),單核體交配后產(chǎn)生子實(shí)體的是親和性交配,不產(chǎn)生子實(shí)體的則為不親和性交配。
2 結(jié)果與分析
2.1ψ幽益咦擁ユ叻擲虢峁
通過(guò)對(duì)C.m.H-07ZY1菌株的子囊孢子單孢彈射分離及轉(zhuǎn)管培養(yǎng),得到9個(gè)子囊孢子單孢菌株。對(duì)這些菌株進(jìn)行誘導(dǎo)子實(shí)體驗(yàn)證培養(yǎng),結(jié)果其中8個(gè)不能產(chǎn)子實(shí)體,1個(gè)能產(chǎn)子實(shí)體,且子實(shí)體形態(tài)正常,子囊殼豐富。對(duì)C.m.H-04G13s9菌株的子囊孢子單孢彈射分離及轉(zhuǎn)管培養(yǎng),得到11個(gè)子囊孢子單孢菌株,進(jìn)行子實(shí)體誘導(dǎo)培養(yǎng),結(jié)果10個(gè)菌株不能產(chǎn)子實(shí)體,1個(gè)菌株能產(chǎn)子實(shí)體,且子實(shí)體形態(tài)正常,子囊殼豐富。
在實(shí)驗(yàn)中鏡檢彈射的子囊孢子時(shí),有時(shí)能觀察到2個(gè)或多個(gè)子囊孢子扭結(jié)在一起未能經(jīng)彈射分離成單孢的情況(見(jiàn)圖1),由此,筆者認(rèn)為以上能產(chǎn)子實(shí)體的分離菌株不是子囊孢子的單孢菌株,而是分離中誤取的2個(gè)或多個(gè)子囊孢子扭結(jié)的混合菌株。這種情況若不加以區(qū)別,將對(duì)交配結(jié)果帶來(lái)極大誤差,也說(shuō)明得到確鑿可靠的子囊孢子單孢是子囊菌中交配型研究的一個(gè)很重要前提。由于許多子囊菌的異核菌絲(在擔(dān)子菌中也稱為次級(jí)菌絲,即有性孢子經(jīng)過(guò)有效配對(duì)融合后形成的菌絲)在子囊菌生活史中能夠存活很長(zhǎng)時(shí)間,若不能取得純子囊孢子單孢菌株,就可能把已經(jīng)異宗配合后的異核菌絲誤認(rèn)為子囊孢子單孢菌株,給交配型研究結(jié)果帶來(lái)極大誤差。為避免上述誤差,本實(shí)驗(yàn)只采用經(jīng)過(guò)驗(yàn)證不能產(chǎn)子實(shí)體的菌株作為下一步單孢配對(duì)試驗(yàn)的菌株。
2.2ψ幽益咦擁ユ呔株配對(duì)培養(yǎng)結(jié)果
將從C.m.H-07ZY1分離得到的8個(gè)單核體菌株兩兩配對(duì)培養(yǎng)誘導(dǎo)子實(shí)體,結(jié)果見(jiàn)表1。按交配的結(jié)果可將這些單核體分為兩組,組內(nèi)菌株間不親和,而組間親和,表1中分別用A和a標(biāo)記其交配因子類型,這樣清楚反應(yīng)出蛹蟲草具有二極性異宗配合習(xí)性,不同交配型菌株在發(fā)生親和性反應(yīng)形成雙核體菌絲后具有良好的可育性,產(chǎn)生子實(shí)體并形成豐富的子囊殼。
子囊菌;A蛹蟲草;A交配型;A異宗配合
蛹蟲草[Cordyceps militaris (L.) Link]又名北冬蟲夏草,分類學(xué)上屬真菌門(Eumycota),子囊菌亞門(Ascomycotina),核菌綱(Pyrenomycetes),球殼目(Sphaeriales),麥角菌科(Clavicepitaceae),蟲草屬(Cordyceps)[1]。蟲草屬真菌是一類具有重要藥用和開(kāi)發(fā)價(jià)值的真菌,其中冬蟲夏草[Cordyceps sinensis (Berk.)Sacc.]為我國(guó)傳統(tǒng)名貴滋補(bǔ)中藥材,由于野生資源稀少,價(jià)格極其昂貴,許多科研單位對(duì)其子實(shí)體人工培養(yǎng)進(jìn)行了大量的研究工作,但至今尚未能規(guī)模培養(yǎng)[2~7]。蛹蟲草作為蟲草屬真菌的模式種,具有與冬蟲夏草相似的藥理功效,且人工規(guī)模培養(yǎng)已經(jīng)成功,正逐漸成為冬蟲夏草的重要替代品,具有廣闊的市場(chǎng)前景。目前有關(guān)蛹蟲草的研究,主要集中于培養(yǎng)條件選擇、有效成分分析和藥理作用研究上[8~20],對(duì)其基本生物學(xué)、遺傳學(xué)等方面的研究仍較薄弱[21~24],對(duì)其交配型的研究幾為空白[25]。
真菌的交配型是控制其交配親和性和有性生殖的遺傳基礎(chǔ)。已知真菌的交配型系統(tǒng)分為同宗配合和異宗配合2大類。同宗配合是一種自體可孕的有性生殖方式,即該真菌不需要兩個(gè)不同來(lái)源的菌絲交配,只由同一有性孢子萌發(fā)生成的初級(jí)菌絲就可獨(dú)立完成有性生活史。同宗配合分成初級(jí)同宗配合(primary homothallism)和次級(jí)同宗配合(secondary homothallism)。異宗配合是一種自體不孕的有性生殖方式,即由同一有性孢子萌發(fā)形成的初級(jí)菌絲不能獨(dú)立完成有性生活史,只有通過(guò)兩個(gè)不同交配型的有性孢子萌發(fā)生成的初生菌絲之間的交配,才能完成有性生活史。異宗配合根據(jù)控制交配型的不親和性因子是一對(duì)還是兩對(duì),也可分為兩類:具有一對(duì)不親和性因子的二極性異宗配合(bipolar heterothallism)和具有兩對(duì)不親和性因子的四極性異宗配合(tetrapolar heterothallism)。就同一菌株所產(chǎn)生的有性孢子間的交配而言,二極性異宗配合菌的可親和率為50%,而四極性異宗配合菌的可親和率為25%,這是判斷是否二極性或四極性異宗配合的基本依據(jù)。在已研究的擔(dān)子菌中,約有90%的種屬于異宗配合真菌,其中,約有25%為二極性異宗配合真菌,75%為四極性異宗配合真菌[26,27]。而對(duì)子囊菌,現(xiàn)有報(bào)道種類中同宗配合占較大比例[27],但研究較多的粗糙脈孢菌(Neurospora crrassa)則為典型的二極性異宗配合真菌(A, a)[28] ;由于缺少像擔(dān)子菌中的鎖狀聯(lián)合一樣的簡(jiǎn)易判斷標(biāo)準(zhǔn),子囊菌關(guān)于交配型的研究比較困難而且報(bào)道較少。本文利用能在人工條件下完成全部生活史、并能較容易地分離到子囊孢子單孢的蛹蟲草菌種,率先進(jìn)行了其交配特性的研究,旨在豐富對(duì)子囊菌的交配特性的認(rèn)識(shí),為蟲草屬內(nèi)不同真菌的交配特性研究提供參考。
1 材料與方法
1.1κ匝椴牧
實(shí)驗(yàn)所用的2個(gè)蛹蟲草菌株C.m.H-07ZY1和C.m.H-04G13s9均采自長(zhǎng)白山區(qū),為本實(shí)驗(yàn)室在大量分離純化和篩選基礎(chǔ)上獲得的能成功培養(yǎng)出正常子實(shí)體的菌株。
1.2ε嘌基
PDA培養(yǎng)基:土豆200 g(煮汁),葡萄糖20 g,瓊脂20 g,水1000 mL,用于菌種分離和保存;
PDB培養(yǎng)基:土豆200 g(煮汁),葡萄糖20 g,水1000 mL,用菌種液體培養(yǎng);
米飯培養(yǎng)基:25 g大米加35 g水,高壓滅菌后作為子實(shí)體培養(yǎng)基。
高新華:蛹蟲草(Cordyceps militaris)的交配型研究
1.3ψ郵堤迦斯づ嘌方法
將在PDA斜面活化的蛹蟲草菌種接種于PDB液體培養(yǎng)基中(75 mL/250 mL),轉(zhuǎn)速150 rpm、25 ℃下振蕩培養(yǎng)3 d,再將所得的液體菌種稀釋(約100倍)轉(zhuǎn)接于瓶裝米飯培養(yǎng)基上(4 mL/瓶),瓶蓋中墊上濾紙,以避免空氣交換可能引發(fā)的污染,于25 ℃暗培養(yǎng)3~4 d,當(dāng)觀察到菌絲已明顯在培養(yǎng)基表面開(kāi)始蔓延時(shí),轉(zhuǎn)至光培養(yǎng)室,光照強(qiáng)度以室內(nèi)散射光為準(zhǔn),培養(yǎng)溫度調(diào)至22 ℃。培養(yǎng)18 d左右,子實(shí)體原基開(kāi)始出現(xiàn),50~55 d左右,子實(shí)體成熟并開(kāi)始彈射子囊孢子。
1.4ψ幽益咦擁ユ叻擲
取蛹蟲草成熟子座,倒置固定于不相接觸的PDA培養(yǎng)基上方,使子囊孢子可以彈射到培養(yǎng)基平板上。22 ℃恒溫培養(yǎng)2~3 d后,分別挑取子囊單孢菌落轉(zhuǎn)接至PDA斜面上,22 ℃恒溫培養(yǎng),待菌絲長(zhǎng)滿斜面后保存?zhèn)溆谩?
1.5ψ幽業(yè)ユ叻擲刖株的配對(duì)及子實(shí)體誘導(dǎo)
將分離得到的單孢菌絲轉(zhuǎn)接于PDB液體培養(yǎng)基中25 ℃振蕩培養(yǎng)3~5 d,將所得液體單孢菌種單獨(dú)接種于米飯培養(yǎng)基上培養(yǎng)以誘導(dǎo)產(chǎn)子實(shí)體,即為單孢培養(yǎng)產(chǎn)子實(shí)體試驗(yàn);將所得液體單孢菌種兩兩配對(duì)混合后接種于米飯培養(yǎng)基上培養(yǎng)以誘導(dǎo)產(chǎn)子實(shí)體,即為配對(duì)培養(yǎng)產(chǎn)子實(shí)體試驗(yàn)。每個(gè)培養(yǎng)樣品10個(gè)重復(fù),子實(shí)體誘導(dǎo)培養(yǎng)方法如1.3中所述。
1.6ν核體和異核體的鑒定
從單孢菌株的培養(yǎng)和配對(duì)結(jié)果看,單孢分離菌株與親本菌株菌絲生長(zhǎng)無(wú)明顯差異,菌株之間也沒(méi)有明顯形態(tài)方面的差異,結(jié)合子實(shí)體誘導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)果,本實(shí)驗(yàn)將菌株是否能形成子實(shí)體作為區(qū)分同核體和異核體的標(biāo)準(zhǔn),即正常條件下不能形成子實(shí)體的單孢分離株為單核的單孢分離株,而產(chǎn)生子實(shí)體的則不是。以此標(biāo)準(zhǔn),單核體交配后產(chǎn)生子實(shí)體的是親和性交配,不產(chǎn)生子實(shí)體的則為不親和性交配。
2 結(jié)果與分析
2.1ψ幽益咦擁ユ叻擲虢峁
通過(guò)對(duì)C.m.H-07ZY1菌株的子囊孢子單孢彈射分離及轉(zhuǎn)管培養(yǎng),得到9個(gè)子囊孢子單孢菌株。對(duì)這些菌株進(jìn)行誘導(dǎo)子實(shí)體驗(yàn)證培養(yǎng),結(jié)果其中8個(gè)不能產(chǎn)子實(shí)體,1個(gè)能產(chǎn)子實(shí)體,且子實(shí)體形態(tài)正常,子囊殼豐富。對(duì)C.m.H-04G13s9菌株的子囊孢子單孢彈射分離及轉(zhuǎn)管培養(yǎng),得到11個(gè)子囊孢子單孢菌株,進(jìn)行子實(shí)體誘導(dǎo)培養(yǎng),結(jié)果10個(gè)菌株不能產(chǎn)子實(shí)體,1個(gè)菌株能產(chǎn)子實(shí)體,且子實(shí)體形態(tài)正常,子囊殼豐富。
在實(shí)驗(yàn)中鏡檢彈射的子囊孢子時(shí),有時(shí)能觀察到2個(gè)或多個(gè)子囊孢子扭結(jié)在一起未能經(jīng)彈射分離成單孢的情況(見(jiàn)圖1),由此,筆者認(rèn)為以上能產(chǎn)子實(shí)體的分離菌株不是子囊孢子的單孢菌株,而是分離中誤取的2個(gè)或多個(gè)子囊孢子扭結(jié)的混合菌株。這種情況若不加以區(qū)別,將對(duì)交配結(jié)果帶來(lái)極大誤差,也說(shuō)明得到確鑿可靠的子囊孢子單孢是子囊菌中交配型研究的一個(gè)很重要前提。由于許多子囊菌的異核菌絲(在擔(dān)子菌中也稱為次級(jí)菌絲,即有性孢子經(jīng)過(guò)有效配對(duì)融合后形成的菌絲)在子囊菌生活史中能夠存活很長(zhǎng)時(shí)間,若不能取得純子囊孢子單孢菌株,就可能把已經(jīng)異宗配合后的異核菌絲誤認(rèn)為子囊孢子單孢菌株,給交配型研究結(jié)果帶來(lái)極大誤差。為避免上述誤差,本實(shí)驗(yàn)只采用經(jīng)過(guò)驗(yàn)證不能產(chǎn)子實(shí)體的菌株作為下一步單孢配對(duì)試驗(yàn)的菌株。
2.2ψ幽益咦擁ユ呔株配對(duì)培養(yǎng)結(jié)果
將從C.m.H-07ZY1分離得到的8個(gè)單核體菌株兩兩配對(duì)培養(yǎng)誘導(dǎo)子實(shí)體,結(jié)果見(jiàn)表1。按交配的結(jié)果可將這些單核體分為兩組,組內(nèi)菌株間不親和,而組間親和,表1中分別用A和a標(biāo)記其交配因子類型,這樣清楚反應(yīng)出蛹蟲草具有二極性異宗配合習(xí)性,不同交配型菌株在發(fā)生親和性反應(yīng)形成雙核體菌絲后具有良好的可育性,產(chǎn)生子實(shí)體并形成豐富的子囊殼。
