雙孢蘑菇三種類型菌株的RAPD擴增研究

陳美元 廖劍華 王澤生

(福建省輕工業(yè)研究所,福州,350005)

摘 要 使用72個隨機引物，對三種類型雙孢蘑菇菌株2796(雜交型)，8211(優(yōu)質(zhì)型)，01等(高產(chǎn)型)進(jìn)行RAPD擴增，發(fā)現(xiàn)26個引物均產(chǎn)生三種不同的帶型。進(jìn)一步用該26個引物作三種類型9株雙孢蘑菇白色菌株的 RAPD擴增，發(fā)現(xiàn)引物U16、U20、B1、H4、H5、M7可很好地區(qū)分三類菌株，其中尤以U20和H5為佳，其產(chǎn)生的三種帶型穩(wěn)定整齊，差異帶明顯， 為雙孢蘑菇菌株特性的早期預(yù)測提供了DNA水平的標(biāo)記。

關(guān)鍵詞 雙孢蘑菇，RAPD，菌株類型

繼同核不育單孢分離物配對雜交育種、原生質(zhì)體融合等細(xì)胞水平的育種技術(shù)之后，雙孢蘑菇的遺傳育種已進(jìn)入了分子水平，其成果主要有同工酶電泳法鑒定種性[1]，染色體混合標(biāo)記連鎖圖的建立[2]，纖維素酶、漆酶基因的克隆[3,4]，性因子的定位[5]等。而每個成果的取得，都離不開各種遺傳標(biāo)記在該物種研究上的應(yīng)用及不斷更新。

隨機擴增的多態(tài)性DNA(RAPD，Random Amplified Polymorphic DNA)技術(shù)在生命科學(xué)的許多研究領(lǐng)域已得到廣泛的應(yīng)用，包括遺傳多態(tài)性研究、分類研究、遺傳關(guān)系分析、某些特定基因標(biāo)記、作連鎖圖譜等。 這種以PCR反應(yīng)為基礎(chǔ)的技術(shù)克服了同工酶和RFLP等技術(shù)的一些缺點，具有快速、安全、簡便、靈敏度高、需樣量少的特點。在雙孢蘑菇研究中，Xu等人以RFLP和RAPD標(biāo)記為輔助將性因子定位在染色體I上[4]，美國Amycel公司找到了一個與雙孢蘑菇子實體顏色性狀強度連鎖的RAPD標(biāo)記[6]，Khush等則用該技術(shù)作了雙孢蘑菇遺傳親子的分析[7]。但由于缺少合適的引物和系統(tǒng)的菌株，至今在雙孢蘑菇遺傳育種上尚未得到更為有效的應(yīng)用。本研究通過多個引物和菌株的RAPD試驗，以期找出一種適用于雙孢蘑菇菌株種性預(yù)測的、操作快速準(zhǔn)確的遺傳標(biāo)記。

１ 材料與方法

1.1 菌株

雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)雜交菌株(同工酶表型[1]HG4)2796、3003，優(yōu)質(zhì)菌株(同工酶表型G)8211、C1、福罐4，高產(chǎn)菌株(同工酶表型H)01、02、沙洲24-3、126均由福建省蘑菇菌種研究推廣站提供。

1.2 PCR試劑

1.2.1 Taq酶:promega產(chǎn)品，使用前稀釋成0.5U/ul

1.2.2 10×buffer:Promega產(chǎn)品

1.2.3 MgCl2:25mM，Promega產(chǎn)品

1.2.4 隨機引物:Sangon產(chǎn)品，稀釋成約3.7uM使用，其編號為U1-U20，B1-B10，H1-H10，X1-X10，M1-M10，R1-R10，W1，W2

1.2.5 dNTPs:華美公司產(chǎn)品，每種2.5mM

1.3 總DNA模板的提取

按朱衡等的方法[8]稍作改動。從PDA斜面上刮下蘑菇菌絲(約0.1g)，冰凍后砸碎，置1.5ml eppendorf管中，加500ul提取緩沖液(100mM Tris-Cl，40mM EDTA，pH8.0)混勻，加100ul 10%SDS， 300ul氯化芐，旋渦振蕩成乳狀，50℃水浴1hr(每隔15分鐘顛倒混勻一次)，加300ul 3M NaAc(pH5.2)混勻，冰浴1hr，臺式冷凍離心機上10000rpm 4 ℃離心10分鐘，上清吸至另一離心管中，加入等體積異丙醇室溫沉淀20分鐘，臺式離心機13000rpm10分鐘，沉淀用70%乙醇洗一次，吹干后溶于20ulTE(10mM Tris-Cl，1mM EDTA，pH8.0)。使用前用無菌去離子水稀釋5-15倍(使DNA終濃度約為15-20ng/ul)。

1.4 RAPD擴增反應(yīng)[9]

采用15ul擴增體系:在0.2ml PCR管(PE公司產(chǎn)品)中加入7.3ul純水,1.5ul 10×buffer, 1.2ulMgCl2，1ul dNTPs，1ul隨機引物，1ul模板DNA，2ul Taq酶，混勻后置PE9600 GeneAmp PCR System上進(jìn)行擴增反應(yīng):94℃2分鐘，1Cycle；94℃ 30秒，45℃30秒，72℃1分鐘，42Cycle;72℃5分鐘,降至4℃。PCR產(chǎn)物加入5ul上樣緩沖液(50%蔗糖,0.2%溴酚藍(lán))，在1.5% 瓊脂糖凝膠上電泳分離，EB染色照相。

２ 結(jié)果與討論

2.1 模板DNA的提取

用本方法提取蘑菇總DNA，得率不太高， 且混有一定量的雜蛋白，但這并不影響它成為PCR反應(yīng)的良好模板，因該反應(yīng)只需微量的DNA粗制品。而且因為是小量提取，并省去蛋白抽提步驟， 故操作簡便快速，可成批提取大量菌株，這對大量菌株(如成批的融合子再生株)的實驗室早期DNA鑒定將十分有利。

2.2 RAPD擴增反應(yīng)

我們以代表雙孢蘑菇三種類型的典型菌株2796(雜交型或HG4型)，8211(優(yōu)質(zhì)型或G型)，SB65或01(高產(chǎn)型或H型)的總DNA為模板，使用72個隨機引物進(jìn)行RAPD擴增，發(fā)現(xiàn)結(jié)果不明朗(無帶或帶模糊)的引物6個，只產(chǎn)生一種帶型的引物10個，產(chǎn)生兩種帶型的引物30個，產(chǎn)生三種帶型的引物26個(結(jié)果未顯示)。這26個引物為:U1，U7，U8，U10，U11 ，U12，U16，U18，U20，B1，B5，B8，B10，H1，H4，H5，H7，H8，X5，X7，X9，M2，M4，M5，M7，M8。進(jìn)一步用這26個隨機引物對三種類型9 株雙孢蘑菇白色菌株(2796，3003；8211，C1，福罐4；01，02，沙洲24-3，126)進(jìn)行RAPD擴增，發(fā)現(xiàn)有6個引物可很好地區(qū)分三種類型菌株，它們是U16，U20，B1，H4，H5，M7，其核苷酸序列分別為CTGCGCTGGA、ACAGCCCCCA、GTTTCGCTCC、GGAAGTCGCC、AGTCGTCCCC、CCGTGACTCA。

其中引物U20和H5產(chǎn)生的帶型穩(wěn)定清晰整齊，差異帶明顯，分型效果最好。U16擴增帶強弱差異顯著，但位置相同；B1與 H4的帶型不夠清晰，希望通過擴增反應(yīng)某些參數(shù)的變化能得以改善；M7帶型清晰，但G型菌株間帶型不完全一致(圖1-6)。

3 討論

在分子水平上，同工酶電泳技術(shù)已被成功地應(yīng)用于雙孢蘑菇的種性預(yù)測[1]。根據(jù)電泳帶型可把雙孢蘑菇分為高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、雜交、不育四大類型。本文在同工酶分型的基礎(chǔ)上，對雙孢蘑菇三種類型菌株進(jìn)行了RAPD研究，找到了能區(qū)分三種類型菌株的6個引物，并從另一個角度證實了同工酶分型的可靠性。

圖中具相同帶型的菌株并非同一菌株，而是同一類型菌株。這意味著，這幾個引物擴增出的差異譜帶與菌株的三種性狀（高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、雜交類型）可能具有相關(guān)性。我們將用這幾個引物對更多的雙孢蘑菇三種類型典型菌株及一些中間類型的菌株進(jìn)行RAPD擴增試驗，以期找出一種較同工酶更為準(zhǔn)確、快速的雙孢蘑菇實驗室早期種性預(yù)測的遺傳標(biāo)記，更好地指導(dǎo)雙孢蘑菇的育種工作。

另外，我們將肥克隆差異譜帶制成探針，檢測探針與性狀的相關(guān)性。一旦證實這種相關(guān)性，就能建立一種基于特異探針的新的檢測手段，可以對更大量的融合子、轉(zhuǎn)化子再生株進(jìn)行實驗室早期預(yù)測。

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9

圖1 隨機引物U20對9個雙孢蘑菇菌株的RAPD擴增圖譜

Fig.1 RAPD graph of 9 strains of Agaricus bisporus amplified by random primer U20

M為λDNA/EcoRI+HindⅢ Marker，1-9的擴增模板分別為菌株2796，3003，8211，C1，福罐4，01，02，沙洲24-3，126的總DNA。下同。

Lane M:λDNA/EcoRI+HindⅢ Marker;Lane1-9:RAPD banding patterns of the total DNA of strain 2796,3003,8211,C1, Fuguan-4,01,02,Shazhou24-3,126. Similarly here in after.

圖2 隨機引物H5對9個雙孢蘑菇菌株的RAPD擴增圖譜

Fig.2 RAPD graph of 9 strains of Agaricus bisporus amplified by random primer H5

圖3 隨機引物U16對9個雙孢蘑菇菌株的RAPD擴增圖譜

Fig.3 RAPD graph of 9 strains of Agaricus bisporus amplified by random primer U16

圖4 隨機引物B1對9個雙孢蘑菇菌株的RAPD擴增圖譜

Fig.4 RAPD graph of 9 strains of Agaricus bisporus amplified by random primer B1

圖5 隨機引物H4對9個雙孢蘑菇菌株的RAPD擴增圖譜

Fig.5 RAPD graph of 9 strains of Agaricus bisporus amplified by random primer H4

圖6 隨機引物M7對9個雙孢蘑菇菌株的RAPD擴增圖譜

Fig.6 RAPD graph of 9 strains of Agaricus bisporus amplified by random primer M7

參 考 文 獻(xiàn)

1 H. C. Wang and Z. S. Wang. The prediction of strain characteristics of Agaricus bisporus by the application of isozyme electrophoresis. Mushroom Science, 1989. 12(1):87-100.

2 Kerrigan R.W.,P.A.Horgen & J.B.Anderson.A genetic linkage map for Agaricus bisporus.In L.J.L.D.van Griensven(ed.),Genetics and breeding of Agaricus. Pudoc., wageningen. The Netherlands,1991.31-36.

3 Chow,C.M. et al..The cel3 gene of Agaricus bisporus codes for a modular cellulase and is transcriptionally regulated by the carbon cource.Appl. Environ. Microbiol.,1994(8):2779-2785.

4 Perry,C.R.,M.Smith,C.H.Britnell et al..Identification of two laccase genes in the cultivated mushroom Agaricus bisporus. J. Gen. Microbiol., 1993(139): 1209-1218.

5 Xu.J.,Kerrigan R.W.,P.A.Horgen et al.. Localization of the mating type gene in Agaricus bisporus.Appl.Environ.Microbiol., 1993(59):3044-3049.

6 Lottus M.G. et al..Molecular mushroom breeding.In T.J.Elliott (ed.), Science and cultivation of edible fungi.Baldema,Rotterdam.the Netherlands,1995.3-9

7 Khush R.S.,Becker E. and M. Wach. DNA Amplification polymorphisms of the cultivated mushroom Agaricus bisporus. Appl.Environ.Microbial., 1992. 58:2971-2977.

8 朱衡,瞿峰,朱立煌.利用氯化芐提取適于分子生物學(xué)分析的真菌DNA. 真菌學(xué)報, 1994.13(1):34-40

9 J.薩姆布魯克,E.F.弗里奇,T.曼尼阿蒂斯.分子克隆實驗指南.第二版. 北京:科學(xué)出版社,1995.672-683。

Study on the RAPD amplification of strains

of three types of Agaricus bisporus

Meiyuan Chen Jianhua Liao Zesheng Wang

(Fujian Research Institute of Light Industry,Fuzhou,350005)

Abstract Three types of A.bisporus strains including 2796 (Hybrid type),8211(Good-quality type) and SB65 or 01(High-yield type) have been studied by RAPD amplification reaction with 72 random primers.It was found that 26 primers all presented three different banding patterns respectively. The further study was carried out with the 26 primers and 9 strains of three types of A.bisporus.As a result, 6 primers,U16,U20,B1,H4,H5 and M7, can distingish the three types of strains very well. The primers U20 and H5 are the better for the banding patterns they produced are stable and regular, and the different bands are obvious. It may provide a marker at DNA level for the prediction of the strain characteristics of A.bisporus.

Key words Agaricus bisporus, RAPD, Strain type